微血管周細(xì)胞及其與糖尿病視網(wǎng)膜病變

邱滿玲 潘銘東 江蕊 徐朝陽(yáng) 任秉儀 劉光輝

1873年，法國(guó)科學(xué)家Charles Rouget首次描述了一類從毛細(xì)血管壁上分離得來的具有伸縮性呈現(xiàn)透明無色素的細(xì)胞，并命名為“外膜細(xì)胞(adventitial cells)”[1]。在之后很長(zhǎng)的一段時(shí)期內(nèi)，這一類細(xì)胞還被賦予了多個(gè)名稱，如：“rouget cells”、“intramembranous pericapillary cells”、“mural cells”、“pericapillary cells”、“periendothelial cells”、“perivascular cells”、“deep cells”等。1923年，Zimmermann等采用銀染技術(shù)研究了這種細(xì)胞，其認(rèn)為這種細(xì)胞：(1)廣泛存在于各種動(dòng)物的體內(nèi)毛細(xì)血管，如魚類、鳥類、兩棲類、爬行類、哺乳類動(dòng)物；(2)與動(dòng)脈及靜脈管壁平滑肌細(xì)胞相延續(xù)；(3)存在高度分化的細(xì)胞亞型，處于不同毛細(xì)血管床的細(xì)胞包漿突觸明顯不同。Zimmermann將其命名為“周細(xì)胞(pericyte)”[2]，這一名稱至今已被廣泛接受并使用。

周細(xì)胞是一類相對(duì)未分化的細(xì)胞，現(xiàn)在一般認(rèn)為微血管內(nèi)皮細(xì)胞旁的間葉細(xì)胞即為周細(xì)胞，其包括：(1)束腰樣圍繞毛細(xì)血管的收縮、游動(dòng)的細(xì)胞；(2)毛細(xì)血管外壁的分支收縮細(xì)胞或基底膜外包繞毛細(xì)血管前動(dòng)脈的長(zhǎng)收縮細(xì)胞；(3)毛細(xì)血管或小血管中的相對(duì)未分化的細(xì)條狀細(xì)胞，即外膜細(xì)胞；(4)毛細(xì)血管平滑肌細(xì)胞或包繞毛細(xì)血管的寬大扁平伴細(xì)長(zhǎng)突起的細(xì)胞；(5)小血管壁上干細(xì)胞樣或間葉細(xì)胞樣細(xì)胞[3]。

一、周細(xì)胞的定位

周細(xì)胞位于毛細(xì)血管前微動(dòng)脈、毛細(xì)血管、毛細(xì)血管后小靜脈及回流小靜脈的管壁。其緊靠微血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過突觸等與內(nèi)皮細(xì)胞相連，外圍由基底膜環(huán)繞包圍。周細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜三者共同構(gòu)成微血管管壁(圖1)。其中毛細(xì)血管前微動(dòng)脈、毛細(xì)血管后小靜脈的血管周細(xì)胞在表型上逐漸向血管平滑肌細(xì)胞過渡，被稱為過渡型周細(xì)胞。

周細(xì)胞的數(shù)量在不同的組織器官甚至不同的微血管床中都存在很大的差異。在骨骼肌中，周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的比例約為1:100，腦組織中約為1:4，在視網(wǎng)膜組織中最高，約為1:1[4]。周細(xì)胞在毛細(xì)血管前小動(dòng)脈及毛細(xì)血管中數(shù)量較少，分布稀疏，而在毛細(xì)血管后小靜脈及回流小靜脈中數(shù)量眾多，密度較高[4]。

二、周細(xì)胞的形態(tài)

周細(xì)胞核呈圓形突起，顯著區(qū)別于內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)長(zhǎng)型核，細(xì)胞核周圍由包漿包繞。其胞體發(fā)出數(shù)個(gè)細(xì)胞突起，突起逐漸分支變細(xì)，包繞微血管管壁，末梢最終延伸到內(nèi)皮細(xì)胞附近，與內(nèi)皮細(xì)胞特征性接觸(圖 1)。通常，每100 μm微血管片段約有90個(gè)0.3～0.8 μm寬的突起[4]，毛細(xì)血管后小靜脈周細(xì)胞的突起較其他位置的周細(xì)胞更多。

不同位置的周細(xì)胞與微血管接觸的方式各異，其突起具有不同的表型[3]，表現(xiàn)為：(1)細(xì)胞突起寬大，扇形樣包繞血管(圖 1a)；(2)細(xì)胞突起呈指樣，局限性包繞血管(圖 1b)；

圖1 周細(xì)胞在微血管中的位置。周細(xì)胞沿著管壁發(fā)出大量突觸包繞微血管(圖左)。周細(xì)胞位于內(nèi)皮細(xì)胞外側(cè)，二者由基底膜包繞，兩細(xì)胞間除細(xì)胞連接外空隙由基底膜樣物質(zhì)填充(圖右)；a-d表示不同的周細(xì)胞的突觸及形態(tài)

(3)周細(xì)胞正在遷移，細(xì)胞突起呈回縮樣(圖 1c)；(4)周細(xì)胞正在縱向遷移，細(xì)胞突起沿著血管長(zhǎng)軸分布，多見于新生血管(圖 1d)。在正常的微血管中，周細(xì)胞表型以包繞型為主。在病理情況下，則遷移型為主。不同表型并非代表著不同的細(xì)胞亞型，而是代表不同的功能分化。

在電鏡下觀察[5]，周細(xì)胞由基底膜包繞，其細(xì)胞核呈扁平狀、圓盤樣，核絕大部分為異染色質(zhì)，周圍環(huán)繞含有細(xì)胞器及線粒體的細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)中除基質(zhì)外，含有高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為主。同時(shí)，胞質(zhì)中含有許多突起，內(nèi)含大量肌絲。肌絲中含有大量的平滑肌肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白，及部分非平滑肌肌動(dòng)蛋白和cGMP依賴性蛋白激酶。新生血管中的周細(xì)胞核較常規(guī)大，且以常染色體為主，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)較少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為主。周細(xì)胞內(nèi)、外表面的細(xì)胞膜存在大量的穴樣內(nèi)陷。在基底膜間隔的區(qū)域外，周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞彼此間通過嵌合連接(peg-socket contacts)及粘著斑(adhesion plaques)相互連接。

三、周細(xì)胞的來源

當(dāng)前，周細(xì)胞的來源還存在一定的爭(zhēng)議。因周細(xì)胞與大血管周圍的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells vSMCs)在功能等方面具有的極大相似性，研究認(rèn)為周細(xì)胞與vSMCs屬于同一個(gè)細(xì)胞系。

周細(xì)胞起源的早期研究認(rèn)為壁細(xì)胞源于集結(jié)在內(nèi)皮細(xì)胞管近腔側(cè)的間充質(zhì)細(xì)胞。然而，大量的細(xì)胞世系追蹤研究表明血管系統(tǒng)中成熟的vSMCs有著不同的發(fā)展起源，盡管他們?cè)谛螒B(tài)及分子標(biāo)記方面具有一定的相似性。

在主動(dòng)脈及其鄰近的分支，vSMCs至少存在四種不同的來源——第二心域、神經(jīng)嵴、體節(jié)及臟壁中胚層，這些不同來源的vSMCs呈節(jié)段性分布[6]。而頭部包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的絕大部分壁細(xì)胞可能源于神經(jīng)嵴[7]，胸腺的周細(xì)胞也來源于此[8]。腸[9]、肺[10]、肝[11]的血管壁細(xì)胞起源則歸于間皮系統(tǒng)。心臟的血管壁細(xì)胞來源與這些臟器相似。心外膜間皮被認(rèn)為與心臟間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)，包括心臟vSMCs和周細(xì)胞[12]。這意味著在體腔器官壁細(xì)胞發(fā)生中，可能存在一個(gè)共同的途徑，即間皮細(xì)胞經(jīng)過上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、分層、移行進(jìn)入相應(yīng)器官, 分化纖維細(xì)胞、vSMCs及周細(xì)胞等間充質(zhì)成分。

盡管上述的一類研究已經(jīng)揭示了一些特定器官的周細(xì)胞存在著共同細(xì)胞世系，但是周細(xì)胞的明確起源還有待進(jìn)一步研究。

四、周細(xì)胞標(biāo)記物及鑒定

在既往研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量周細(xì)胞的分子標(biāo)記物，如α-SMA(平滑肌肌動(dòng)蛋白-α)、Desmin(結(jié)蛋白)、PDGFR-β(血小板衍生生長(zhǎng)因子受體-β)、NG2(硫酸軟骨素蛋白多糖4)、CD13 (丙氨酰氨肽酶)、RGS5(G 蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)因子5)、SUR2、Kir6.1、DLK1 (穿膜蛋白)、Endosialin及轉(zhuǎn)基因標(biāo)記物XlacZ4、NG2 dsRED等[5]。在近年，也還有新的標(biāo)記物被應(yīng)用到研究中，如Gli1[13]、Tbx18[14]。

周細(xì)胞的標(biāo)記物在不同的組織器官中表達(dá)不同，同時(shí)這些標(biāo)記物的表達(dá)水平會(huì)隨著周細(xì)胞發(fā)育、病理狀態(tài)及體外培養(yǎng)情況等的變化而波動(dòng)。Morikawa等發(fā)現(xiàn)毛細(xì)血管周細(xì)胞Desmin表達(dá)陽(yáng)性，但是通常不表達(dá)α-SMA，而微靜脈周細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Desmin和α-SMA[15]。Kir6.1在部分腦組織血管周細(xì)胞中高度表達(dá)，但在其他位置幾乎不表達(dá)[16]。研究人員還發(fā)現(xiàn)，小動(dòng)脈周細(xì)胞與竇狀毛細(xì)血管周細(xì)胞NG2表達(dá)也存在差異[17，18]，甚至還在皮膚中同時(shí)發(fā)現(xiàn)了NG2陽(yáng)性和NG2陰性表達(dá)的周細(xì)胞[19]。

基于周細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)的差異性，沒有一種分子標(biāo)記物能特異標(biāo)記所有組織中的周細(xì)胞。從鑒定角度而言，也并非所有的標(biāo)記物都具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。目前，細(xì)胞體外培養(yǎng)鑒定中常用的經(jīng)過有效性檢驗(yàn)的有α-SMA、Desmin、PDGFR-β、NG2、CD13等5種，其特征參見表1。

表1 周細(xì)胞常見標(biāo)記物及其特征

此外，值得一提的是，周細(xì)胞與vSMCs功能相近，可能屬于同一細(xì)胞世系，但是二者在位置、形態(tài)及標(biāo)記物表達(dá)方面還是存在顯著的差異。周細(xì)胞形態(tài)視分布位置不同而變化，從中型血管到小血管，周細(xì)胞可呈現(xiàn)典型vSMCs形態(tài)或典型的周細(xì)胞形態(tài)。周細(xì)胞內(nèi)嵌于微血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜，而vSMCs往往在血管壁中形成單獨(dú)的一層結(jié)構(gòu)-中膜。在標(biāo)記物方面，周細(xì)胞不表達(dá)平滑肌肌球蛋白重鏈(smooth muscle myosin heavy chain SMMHC)和平滑肌22-α(smooth muscle 22-α SM22-α)，此二者在vSMCs中呈陽(yáng)性表達(dá)[20]。

因此，最佳的周細(xì)胞鑒定方式應(yīng)該在組織原位或者切片中進(jìn)行，鑒定時(shí)予以標(biāo)記2種或以上周細(xì)胞標(biāo)記物，同時(shí)標(biāo)記與之對(duì)應(yīng)的ECs，結(jié)合周細(xì)胞形態(tài)觀察確認(rèn)。

五、周細(xì)胞的功能

周細(xì)胞是微血管的重要組成部分，在微血管的病理生理活動(dòng)中具有重要的作用。其能夠：( 1)調(diào)節(jié)血管張力及灌注壓從而調(diào)控血管血流量[21]。周細(xì)胞胞體內(nèi)含有大量肌絲及收縮蛋白，具有收縮的能力，已有研究證明，周細(xì)胞過度收縮引起毛細(xì)血管血流受阻在腦部缺血缺氧中扮演了重要的角色[22]，在基因缺陷的小鼠模型中，周細(xì)胞缺失的小鼠腦部血流調(diào)節(jié)能力減弱[23]。周細(xì)胞還具有大量血管活性分子的受體，如兒茶酚胺、內(nèi)皮素-1、加壓素、血管緊張素[24]。Peppiatt等研究顯示，在大量神經(jīng)遞質(zhì)刺激周細(xì)胞，均能夠引起周細(xì)胞的舒展與收縮，改變大腦微血管的直徑，對(duì)血流進(jìn)行調(diào)控[25]。 (2)參與生理性及病理性新生血管的形成，調(diào)整新生血管的穩(wěn)定性及結(jié)構(gòu)[26]。新生血管結(jié)構(gòu)的發(fā)生、構(gòu)建、穩(wěn)定主要由周細(xì)胞的募集和分化所推動(dòng)[26]。微血管的成熟、穩(wěn)定與管壁周細(xì)胞的分布有很大的關(guān)系，病理性微血管常常伴有周細(xì)胞的缺陷，缺少周細(xì)胞的微血管可表現(xiàn)出局灶性擴(kuò)張、迂曲、微動(dòng)脈瘤[27]，這種表現(xiàn)在糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy DR)中尤為常見。 (3)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化[4]。(4)分泌調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水平從而影響基底膜的形成[28]。(5)通過調(diào)節(jié)ECs緊密連接和粘附連接的位置、數(shù)量及胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)的量，調(diào)控血管壁通透性[29]。(6)執(zhí)行吞噬清理功能[23]。

六、周細(xì)胞與DR

周細(xì)胞凋亡是DR最早的病理特征之一和DR發(fā)生的標(biāo)志，見于DR各個(gè)階段及增生性DR中ECs增生性新生血管的病理過程中。既往的臨床研究顯示，DR患者的視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞存在數(shù)量上的喪失。1996年，Mizutani[30]等報(bào)道了在7例糖尿病病程在(9±4)年的患者的視網(wǎng)膜血管消化鋪片中發(fā)現(xiàn)大量的周細(xì)胞凋亡，而且糖尿病患者的周細(xì)胞數(shù)量凋亡量遠(yuǎn)較非糖尿病患者明顯。另外3例DR患者尸檢報(bào)告[31]顯示，DR患者周細(xì)胞數(shù)量相較ECs減少，通過TUNEL檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)糖尿病患者尸眼較非糖尿病患者尸眼存在大量凋亡細(xì)胞及鬼影細(xì)胞(周細(xì)胞)。Li等[31]據(jù)此認(rèn)為，周細(xì)胞凋亡是DR患者周細(xì)胞喪失的主要原因。

在模型動(dòng)物中，Mizutani[30]、Behl等[32]、劉光輝等[33]等分別報(bào)道了不同病程期的糖尿病大鼠周細(xì)胞凋亡的情況。糖尿病大鼠周細(xì)胞凋亡最早可以出現(xiàn)在糖尿病病程的第12周[33]，并且，隨著病程的延長(zhǎng)，周細(xì)胞凋亡的情況日益嚴(yán)重。研究中發(fā)現(xiàn)相關(guān)的凋亡調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，如Bcl-2/Bax等，也發(fā)生了變化[34]。

基于非嚙齒類種屬的原代周細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)表明，高濃度葡萄糖能夠誘導(dǎo)周細(xì)胞凋亡。Beltramo等[35]報(bào)道高糖/低糖快速波動(dòng)對(duì)周細(xì)胞的生存能力、粘附能力具有一定的影響，而持續(xù)的高糖能明顯誘導(dǎo)周細(xì)胞凋亡[34]，同一水平下恒定高糖較高糖波動(dòng)具有更強(qiáng)的周細(xì)胞增生抑制、周期阻滯及誘導(dǎo)凋亡作用[36]。人周細(xì)胞對(duì)持續(xù)高糖的耐受性較牛周細(xì)胞高，對(duì)高糖/低糖波動(dòng)更為敏感[37]。持續(xù)高糖誘導(dǎo)的周細(xì)胞凋亡可能是基于急性的可逆的損害，血糖波動(dòng)帶來的則是一種累積性的損害，其導(dǎo)致的后果更壞[38]。

當(dāng)前，高糖誘導(dǎo)周細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制仍不甚清楚，主要可能存在以下生化通路：(1)多元醇通路活動(dòng)增強(qiáng)；(2)蛋白激酶C激活；( 3)AGEs合成增多；(4)氨基己糖通路活動(dòng)增強(qiáng)[39]。

醛糖還原酶是一種多元醇通路的關(guān)鍵酶，在生理?xiàng)l件下，能將毒性乙醛轉(zhuǎn)變成不活躍的醛類。然而當(dāng)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)葡萄糖過多，醛糖還原酶則將之轉(zhuǎn)換成山梨醇，期間消耗了大量的NADPH，并引起高糖性缺氧[39]、細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激敏感性提高[40]。細(xì)胞內(nèi)高糖還能通過合成脂質(zhì)第二信使甘油二酯激活PKC合成[41]，引起內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶合成減少，而內(nèi)皮素-1、TGF-β、纖溶酶原激活物抑制劑-1[42]及NF-κB合成增加[43]。

此外，細(xì)胞內(nèi)過量的葡萄糖可以通過席夫堿縮合與蛋白質(zhì)、氨基酸及核酸進(jìn)行反應(yīng)。在這種反應(yīng)初期，其被不可逆性重排為Amadori產(chǎn)物。AGEs可能為自由糖糖氧化產(chǎn)物或活性二羰基片段的產(chǎn)物[44]。AGEs具有一定的毒害性，能夠更改包括調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄蛋白在內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)蛋白[45]，或擾亂細(xì)胞、影響細(xì)胞外基質(zhì)[46]，致使細(xì)胞彼此間粘附能力下降、血管功能失常[47]。也能影響循環(huán)血液蛋白，包括各種炎性因子及生長(zhǎng)因子產(chǎn)物[48]。

最后，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖過高將導(dǎo)致6-磷酸果糖過量，并將其轉(zhuǎn)換氨基葡萄糖-6-磷酸，繼而UDPN乙酰葡糖胺脫氫酶。后者作用于轉(zhuǎn)錄因子的絲氨酸和蘇氨酸殘基，引起基因表達(dá)上的病理學(xué)變化[49]。

雖然當(dāng)前對(duì)DR中周細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制有了一定的認(rèn)識(shí)，但是其確切的凋亡機(jī)制仍然有待進(jìn)一步探索。

七、展望

周細(xì)胞是一種微血管壁的成分細(xì)胞，其在微血管的生理、病理活動(dòng)中扮演了重要的角色，并被視為包括DR等視網(wǎng)膜新生血管疾病在內(nèi)的眾多血管相關(guān)性疾病潛在的治療靶點(diǎn)。近年來，周細(xì)胞的研究日益受到關(guān)注，新的研究擴(kuò)展了周細(xì)胞的傳統(tǒng)定義及人們對(duì)其功能的認(rèn)識(shí)。未來繼續(xù)探索周細(xì)胞的生理、病理功能，深化對(duì)周細(xì)胞的認(rèn)識(shí)，充分揭示周細(xì)胞對(duì)微血管生理、病理的調(diào)控機(jī)制，無疑有助于進(jìn)一步深化對(duì)微血管疾病的系統(tǒng)認(rèn)識(shí)及相關(guān)疾病的治療。