沉默HLA A2表達的骨髓間充質(zhì)干細胞安全性的研究

姚素艷，趙　剛，劉建生，馬萬里，鄭德宇

(錦州醫(yī)科大學：1. 病理生理學教研室；2. 解剖學教研室，遼寧錦州　121001；3. 盤錦市中心醫(yī)院骨外科，遼寧盤錦　124000)

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◇基礎研究◇

沉默HLA A2表達的骨髓間充質(zhì)干細胞安全性的研究

姚素艷1，趙剛2,3，劉建生2，馬萬里2,3，鄭德宇2

(錦州醫(yī)科大學：1. 病理生理學教研室；2. 解剖學教研室，遼寧錦州121001；3. 盤錦市中心醫(yī)院骨外科，遼寧盤錦124000)

摘要：目的探討人白細胞抗原A2(HLA A2)表達沉默后人骨髓間充質(zhì)干細胞(hBMSCs)的安全性。方法實驗分為對照組(正常培養(yǎng)至第8代細胞組)及實驗組1和實驗組2(分別為HLA A2表達沉默后第5代、第15代)。復蘇HLA A2表達沉默的hBMSCs，通過觀察細胞的生長曲線、端粒酶活性和抑癌基因P27的表達水平、細胞周期蛋白依賴激酶4(CDK4)和Cyclin D2的表達水平，分析細胞的安全性。并將細胞接種于裸鼠的皮下，24周后觀察荷瘤組織的種類。結(jié)果實驗組1、實驗組2與對照組相比，細胞生長曲線沒有明顯的左移或右移。HLA A2表達沉默的hBMSCs在沉默HLA A2表達后，3組間的端粒酶活性沒有明顯差異；3組的Cyclin D2、CDK4和抑癌基因P27的表達量也沒有明顯變化。細胞接種于裸鼠皮下24周，只有異位成骨，而沒有形成腫瘤組織。結(jié)論人BMSCs的HLA A2表達沉默后，在實驗周期內(nèi)，沒有明顯證據(jù)表明有安全性的改變。

關鍵詞：人白細胞抗原(HLA)A2；RNA干擾；安全性；人骨髓間充質(zhì)干細胞(hBMSCs)；Cyclin D2；CDK4；P27

在組織工程研究中，來源于自體的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是所有來源的金標準，沒有倫理的限制，沒有免疫排斥反應的發(fā)生。但在實際應用過程，存在自體細胞隨年齡增加數(shù)量減少的趨勢，并且易受病毒污染等缺陷，限制了自體細胞的應用。近年來，人們一直在尋找可以替代的細胞。有學者認為骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是一種免疫豁免細胞，不會引起免疫排斥反應[1]，但也有一些實驗室研究者認為同種異體移植BMSCs存在一定的免疫排斥反應并影響了組織缺損的修復。針對異體種子細胞抗原性引起宿主的免疫排斥反應這一問題，本課題組以往應用RNA干擾方法有效降低了人白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)A基因的表達，在減弱種子細胞抗原性方面取得了明顯進展[2]。但也有實驗研究報道，應用病毒載體將異基因?qū)爰毎?，載體與基因組發(fā)生隨機融合，可以導致某些管家基因的失活或激活原癌基因，引起細胞的基因表達譜變化，誘發(fā)細胞安全性變化[3]。

P27是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，可以抑制原癌基因的活化[4-5]。以往的研究發(fā)現(xiàn)各種類型的腫瘤細胞幾乎P27都低表達。此外，腫瘤細胞也常有一些細胞周期因子的表達異常增高，如細胞周期蛋白依賴性激酶-4(cyclin dependent kinase 4, CDK4)和細胞周期蛋白D2(cyclin D2)等是促進細胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變的細胞周期調(diào)控蛋白分子，可以使細胞由靜止期改變?yōu)樵鲋称赱6]。如果在細胞培養(yǎng)過程中，出現(xiàn)P27表達降低或缺乏，CDK4和Cyclin D2的異常增高，說明細胞可能發(fā)生惡性變[7]，出現(xiàn)致瘤性。

本研究結(jié)合細胞安全性的常規(guī)評價方法和腫瘤細胞的研究進展，針對本課題組中沉默HLA A2表達而降低了抗原性的人BMSCs(hBMSCs)進行安全性評價，從細胞形態(tài)、抑癌基因和細胞周期調(diào)控蛋白的表達以及端粒酶的活性等方面來檢測和評價細胞的安全性。

1 材料與方法

1.1材料HLA A2表達沉默的hBMSCs(由錦州醫(yī)科大學解剖學教研室凍存)，CO2恒溫孵育箱(E191IR，美國SIM公司)，倒置相差顯微鏡(CKX41)，數(shù)碼相機(C-5060，日本Olympus公司)，臺式低速離心機(L80-2B，上海安亭儀器廠)，超凈工作臺(SW-CJ-1FB，蘇州凈化設備有限公司)，胎牛血清、L-DMEM(Gibco)、胰蛋白酶、CDK單克隆抗體、Cyclin D2單克隆抗體、端粒酶檢測試劑盒和小鼠抗HLA-A2單克隆抗體(美國Sigma公司)，DAB顯色試劑盒(北京賽馳)。

1.2HLA A2表達沉默的hBMSCs的復蘇及實驗分組

常規(guī)方法復蘇細胞，以5×105/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞生長融合達80%～90%時，用2.5 g/L胰蛋白酶(含0.2 g/L EDTA)常規(guī)消化傳代[8-9]。

以HLA A2表達沉默后傳5代hBMSCs為實驗組1，HLA A2表達沉默后傳15代hBMSCs為實驗組2，正常hBMSCs培養(yǎng)傳8代為對照組。

1.3繪制細胞生長曲線分別收集實驗組1、實驗組2和對照組細胞，將細胞以1×104/mL密度接種于24孔板中，每孔1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)，從第2天開始，每天消化4孔細胞，計數(shù)，直到細胞數(shù)目不再增加。以每天hBMSCs的平均數(shù)目繪制細胞的生長曲線，觀察細胞生長的變化。

1.4HLA A2表達沉默后的致瘤性檢測

1.4.1端粒酶活性PCR-ELISA檢測[10-11]按試劑盒要求對實驗組1、實驗組2和對照組的hBMSCs進行端粒酶活性PCR-ELISA檢測。以已知端粒酶陽性的人纖維肉瘤HT1080作為陽性對照，以試劑盒自備樣品為陰性對照。陰性對照的最大吸光度(A)值應是0.25(A450～690 nm)。如果此值高，全部實驗包括TRAP應重復。陽性對照(試劑盒提供)的吸光值應高于1.5(A450～690 nm)。如果測定值過低，全部實驗包括TRAP應重復?！鰽，即A樣品-A陰性對照>0.2(A450～690 nm)，則認為該樣品端粒酶陽性。

1.4.2P27、CDK4和Cyclin D2的檢測收集3組細胞，吸棄培養(yǎng)基(或離心去除培養(yǎng)基)，0.1 mol/L PBS洗1次，分別加入裂解緩沖液提取蛋白并測定蛋白含量。煮沸5 min，放置于-20 ℃冰箱中冰凍保存?zhèn)溆?。陽性對照組采用人纖維肉瘤HT1080細胞株。按試劑盒要求，應用Western blot方法檢測P27(1∶1 000)、Cyclin D2(1∶800)和CDK4(1∶500)的表達。

1.4.3荷瘤實驗及HE染色收集實驗組1、實驗組2、對照組和人纖維肉瘤HT1080細胞株各106細胞，接種于裸鼠的皮下，于接種后24周處死動物，取出接種周圍的組織，HE染色，觀察組織結(jié)構。

2結(jié)果

2.1HLA A2表達沉默后hBMSCs復蘇后的狀態(tài)觀察復蘇后的第2天即可見少量的細胞貼壁，大約4 d 時細胞開始增多，約8 d左右細胞能生長融合達到70%～80%。經(jīng)傳代培養(yǎng)后，細胞的生長速度較復蘇時稍快。在熒光顯微鏡下觀察，大部分細胞的細胞質(zhì)及部分胞核顯示綠色熒光(圖1)，與倒置顯微鏡下觀察到的細胞形態(tài)幾乎一致。

圖1HLA A2表達沉默的hBMSCs細胞形態(tài)(bar=100 μm)

Fig.1 The phynotype of the hBMSCs after silencing of HLA A2 expressionA：相差倒置顯微鏡下細胞呈梭形或多角形；B：A圖的同一視野熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染成功的細胞為與細胞形態(tài)幾乎一致的綠色熒光。

2.2細胞的生長曲線實驗組1的hBMSCs在接種后1 d的細胞數(shù)量并沒有明顯增加，2 d開始增加，3 d時細胞生長達到對數(shù)生長期，大約7 d細胞數(shù)量達到極值，之后細胞不再增加反而略有下降。實驗組2與對照組的細胞生長趨勢與實驗組1大致相當，3組間沒有明顯差異。說明hBMSCs在HLA A2表達沉默后，細胞的生長速度并沒有明顯增加或減緩，同時也沒有喪失接觸性抑制的特性(圖2)。

圖2不同處理方法的hBMSCs的生長曲線

Fig.2 Growth curve of hBMSCs treated by different methods

實驗組1：HLA A2表達沉默后傳5代hBMSCs；實驗組2：HLA A2表達沉默后傳15代hBMSCs；對照組：正常培養(yǎng)傳8代的hBMSCs。

2.3hBMSCs在HLA A2表達沉默后的致瘤性檢測結(jié)果

2.3.1TRAP PCR-ELISA檢測端粒酶活性結(jié)果結(jié)果顯示，陰性對照組的端粒酶活性為0.037，陽性對照組的端粒酶活性為2.687。在HLA A2表達沉默的第5代和第15代的hBMSCs的端粒酶活性均小于0.1，分別為0.085和0.064，與對照組0.073相比，沒有明顯差異。但與陽性對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01。表1)。一般細胞端粒酶的活性都小于1.5，故可以認為在正常范圍。

表1端粒酶活性

Tab.1Activities of telomerase activation

±s, n=4)

與陰性對照組相比，##P<0.01；與陽性對照組相比，**P<0.01。

2.3.2P27、CDK4和Cyclin D2的表達變化Western blot檢測顯示，P27蛋白在HLA A2表達沉默后第5代和15代的hBMSCs的表達水平與正常經(jīng)8代培養(yǎng)的hBMSCs表達水平相近，而P27在陽性對照組(人纖維肉瘤細胞株HT1080)的表達明顯降低，幾乎檢測不到目的條帶(圖3)。應用慢病毒載體介導的HLA A2表達沉默未使抑癌基因P27表達改變，提示不引起成瘤的潛在危險。

HLA A2表達沉默后第5代和15代的hBMSCs和正常培養(yǎng)的8代hBMSCs中，Cyclin D2和CDK4呈現(xiàn)出低水平的表達，均明顯弱于陽性對照組的表達(圖3)。

圖3Western blot 檢測各組hBMSCs的P27、CDK4及Cyclin D2的表達變化

Fig.3 The expressions of P27, CDK4 and Cyclin D2 in hBMSCs detected by Western blot

1：對照組； 2：實驗組1(HLA A2表達沉默后第5代)；3：實驗組2(HLA A2表達沉默后第15代)；4：HT1080陽性對照組。

2.3.3荷瘤實驗結(jié)果各組BMSCs接種于裸鼠皮下后，24周處死動物取周圍組織行HE檢測，顯示只有類骨組織(圖4)，分析為BMSCs的異位成骨，而人纖維肉瘤HT1080細胞株接種于祼鼠皮下后，在12周時就可見明顯的腫瘤組織形成。說明HLA A2沉默后在實驗期限內(nèi)沒有形成腫瘤組織。

圖4各組BMSCs種植于裸鼠皮下的異位成骨

Fig.4 Subdermal ectopic bone formation of BMSCs transplanted in the nude mice (×200)

A：HLA A2表達沉默后傳5代的BMSCs；B：HLA A2表達沉默后傳15代的BMSCs；C：正常培養(yǎng)傳8代的BMSCs。

3討論

同種異體的間充質(zhì)干細胞是一種較好的自體間充質(zhì)干細胞的替代細胞，但對于同種異體的BMSCs是否存在抗原性和能否引起免疫排斥反應，不同的實驗室也有不同的觀點。本實驗室結(jié)合實驗中發(fā)現(xiàn)的問題和其他一些實驗室的結(jié)論認為BMSCs存在一定的免疫排斥反應，并且能影響骨缺損的愈合[12-13]。本實驗室以往的研究表明，應用RNA干擾技術，能夠降低HLA A2的表達，抑制同種異體的T淋巴細胞的增殖，減弱免疫排斥反應的發(fā)生[14]。并且這種作用可以維持15代培養(yǎng)時間，即10周以上。但是細胞的安全性尚沒有明確的闡述，本實驗對此進行了初步的探索。

細胞安全性包括細胞的生長特性、細胞核型、動物致瘤性的研究、細胞周期蛋白的表達水平、端粒酶活性和抑癌基因的表達水平等方面。本研究對HLA A2表達沉默后hBMSCs的安全性進行了初步探索，觀察其細胞形態(tài)和生長特性與正常對照組細胞一樣，呈現(xiàn)較為均一的梭形或多角形，細胞中生長達到鋪滿瓶底時，也存在接觸性抑制的特性。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，HLA A2基因表達沉默后的15代細胞的端粒酶活性與正常對照組hBMSCs基本保持在同一水平，雖然較陰性對照組有些差異，但遠低于異常的標準。

Cyclin D2和CDK4是細胞周期重要的調(diào)節(jié)因子，在大部分癌細胞中，Cyclin D2和CDK4表達異常增高，腫瘤細胞分裂增殖異?；钴S，細胞的惡性程度也高。而在正常的細胞，如果由于某種原因引起cyclin D2和CDK4的表達上調(diào)，可能會預示細胞加快了細胞周期，使細胞呈現(xiàn)了致瘤的可能性。本實驗檢測到HLA A2表達沉默的hBMSCs培養(yǎng)第15代時，并沒有Cyclin D2和CDK4的異常增高，與正常對照組或陰性對照組沒有明顯區(qū)別。

P27基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一個重要的抑癌基因，能夠調(diào)控細胞周期并且具有抑制細胞分裂的重要作用，其編碼的P27蛋白屬于細胞周期蛋白依賴性抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors, CKIs)家族中的一員，對細胞周期蛋白依賴性激酶具有廣譜抑制作用[15-16]。在很多的腫瘤細胞中也存在有P27表達下降甚至不表達的現(xiàn)象，這會減弱或失去P27的抑制作用，可使細胞不受細胞周期調(diào)控點的限制而迅速增生，促使腫瘤的發(fā)生[17-18]。本實驗慢病毒載體導入干擾RNA片段沉默HLA A2表達傳15代時，相當正常培養(yǎng)細胞的傳第18代，P27的表達量正常，與正常培養(yǎng)傳8代的BMSCs表達量相差無幾，遠遠高于人纖維肉瘤細胞株HT1080。

以上均提示，應用RNA干擾技術選擇慢病毒載體向BMSCs中導入小干擾序列降低HLA A2的表達，可減弱同種異體的BMSCs的抗原性。進一步將HLA A2沉默后的hBMSCs接種到裸鼠的皮下后，在6個月內(nèi)只形成異位骨組織，而對照組HT1080則在2個月時就形成明顯的腫瘤組織。說明在所進行實驗的時間內(nèi)，這種降低抗原性的hBMSCs是安全的，不具有致瘤和致畸的危險，可以作為組織工程中的種子細胞進行后續(xù)的研究。

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(編輯國榮)

收稿日期：2015-07-22修回日期：2016-01-30

基金項目：遼寧省自然科學基金資助項目(No.2013022066，2013022048)，遼寧省教育廳創(chuàng)新團隊項目(No.LT2012016)和一般項目(No.L2013335)資助

通訊作者：鄭德宇. E-mail: zdy4673349@163.com

中圖分類號：R322.4

文獻標志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604005

Safety of the bone marrow derived mesenchymal stem cells after HLA A2 gene silencing

YAO Su-yan1, ZHAO Gang2,3, LIU Jian-sheng2, MA Wan-li2,3, ZHENG De-yu2

(1.Department of Pathophysiology, 2. Department of Anatomy,Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001; 3. Department of Orthopedic Surgery,Central Hospital of Panjin, Panjin 124000, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the safety of the human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hBMSCs) after silencing of human leukocyte antigen A2 expression. MethodsWe divided the cells into three groups: normal cultured cells of the 8th passage served as control group, and hBMSCs after HLA A2 silencing expression of the 5th and 15th passage as experimental groups 1 and 2, respectively. The hBMSCs were recultured by sterile methods. The growth curve, telomerase activation, and expressions of P27, cyclin D2 and cyclin-dependent kinase 4 (CDK4) were utilized to explore the safety of the hBMSCs induced by LV-siRNA-HLA A2. The BMSCs were transplanted to the subcutaneous layer of nude mice. Tissue types were detected 24 weeks after transplantation. ResultsThe cell curves had no obvious left or right shift in all the groups. The telomerease activation in experimental groups 1 and 2 did not significantly differ from those in control group. The expressions of anti-oncogene P27, cyclin D2 and CDK4 had no obvious difference between the two experimental groups and control group, either. There was only ectopic osteogenesis 24 weeks after the BMSCs (HLA A2 gene silenced) were transplanted to the subcutaneous layer of the nude mice. ConclusionThere was no obvious evidence to support that hBMSCs had undergone change in safety after the silencing of HLA A2 expression.

KEY WORDS:HLA A2; RNA interference; safety; human bone marrow-derived mesenchymal stem cell (hBMSC); Cyclin D2; CDK4; P27

Supported by the Natural Science Foundation of Liaoning Province (No.2013022066, 2013022048) and Innovative Team Foundation (No. LT2012016) and Common Foundation of the Department of Education of Liaoning Province (No.L2013335)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160608.0922.010.html(2016-06-08)