UPLC-MS/MS法同時測定人血漿中5種抗真菌藥物的血藥濃度

姚遠(yuǎn)，盧偉，呂光輝*（.十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院）兒科，湖北 十堰 44000；.十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院）藥學(xué)部，湖北 十堰 44000）

研究表明，接受骨髓移植、器官移植以及免疫抑制劑治療的患者是真菌感染的高發(fā)人群[1]。此外，腫瘤、艾滋病、侵入性置管以及廣譜抗菌藥物的使用是侵襲性真菌感染的主要危險因素[2]?，F(xiàn)階段抗真菌藥物主要包括唑類、棘白菌素類和多烯類，臨床上全身給藥的代表藥物有伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、氟康唑和卡泊芬凈[3]。

唑類抗真菌藥物體內(nèi)代謝特征存在個體差異，如氟康唑在腎功能不全患者或中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌感染患者體內(nèi)暴露量會顯著增加[4]；不同劑型的伊曲康唑生物利用度差異很大（膠囊和口服液生物利用度分別為55%和70%）[5]；伏立康唑為非線性藥動學(xué)特征，血藥濃度差異很大[6]；泊沙康唑在藥動學(xué)方面也存在顯著差異[7]?？ú捶覂魹榧拙仡惪拐婢?，具有抗菌譜廣、交叉耐藥少以及安全性高等特點，是肝功能受損患者抗真菌藥物的首選；但卡泊芬凈體內(nèi)藥動學(xué)過程受諸多因素影響，表觀分布容積改變、多器官功能衰竭以及藥物間相互作用等均會導(dǎo)致體內(nèi)血藥濃度個體間差異增大，肝損傷、低白蛋白血癥等同樣會影響卡泊芬凈血藥濃度[8]。抗真菌藥物也會與其他聯(lián)用藥物產(chǎn)生相互作用[9]。因此，對抗真菌藥物在特殊人群中開展治療藥物監(jiān)測（therapeutic drug monitoring，TDM）在藥物選擇和給藥方案的制訂中具有重要的意義。本研究選取臨床中常見的抗真菌藥物作為研究對象，建立同時測定5 種抗真菌藥物的UPLC-MS/MS 方法，為抗真菌藥物藥動學(xué)/藥效學(xué)（pharmacokinetics/pharmacodynamics，PK/PD）研究以及臨床合理用藥提供幫助。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity 超高效液相色譜儀、XEVO TQ串聯(lián)質(zhì)譜儀[沃特世科技（上海）有限公司]，純水儀（GWAUN1，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），分析天平[AUW120D，島津（上海）實驗器材有限公司]，渦旋混合器（VORTEX-6，海門市其林貝爾儀器制造有限公司），冷凍高速離心機（5427R，Eppendorf 公司）。

1.2 試藥

伏立康唑（批號：20190522，純度＞98.0%，山東西亞化學(xué)股份有限公司），泊沙康唑（批號：K24J10M91205，純度≥99.0%）、氟康唑（批號：J09M6B1，純度≥98.0%）（上海源葉生物科技有限公司），伊曲康唑（批號：100631-201402，純度：99.2%）、卡泊芬凈（批號：B22D7R27470，純度≥98.0%）、替硝唑（批號：100336-201704，純度：99.5%）（中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（批號：JA031530）、甲醇（批號：L1084007014）（色譜級，Merck KGaA 公司），甲酸（色譜級，批 號：095342，MREDA TECHNOLOGY INC），水為自制超純水?？瞻籽獫{由本院輸血科提供，患者血漿來自本院各病區(qū)和檢驗科。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 分別精密稱取伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、氟康唑和卡泊芬凈對照品適量，用甲醇-二甲基亞砜（50∶50，V/V）混合溶液溶解，配成質(zhì)量濃度分別為1.02、1.10、1.21、4.01和1.20 mg·mL－1的對照品儲備液。取適量儲備液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為102.0、110.0、121.0、401.0 和120.0 μg·mL－1的混合對照品溶液。取混合對照品溶液，用甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度工作溶液（伏立康唑：10.2、5.1、2.04、1.02、0.51 和0.204 μg·mL－1，泊沙康唑：11.00、5.50、2.20、1.10、0.55 和0.22 μg·mL－1，伊曲康唑：12.10、6.05、2.42、1.21、0.605 和0.242 μg·mL－1，氟康唑：40.10、20.05、8.02、4.01、2.005 和0.802μg·mL－1，卡泊芬凈：12.00、6.00、2.40、1.20、0.60和0.24 μg·mL－1）。同時采用甲醇配制質(zhì)控樣品溶液，氟康唑質(zhì)控樣品質(zhì)量濃度為32.08、6.42、1.28 μg·mL－1，其他化合物質(zhì)控樣品質(zhì)量濃度約為8.0、1.6、0.32 μg·mL－1，所有溶液置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 內(nèi)標(biāo)工作液 精密稱取替硝唑?qū)φ掌罚尤爰状?二甲基亞砜（V/V，50∶50）混合溶液溶解，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL－1的內(nèi)標(biāo)儲備液。取適量儲備液，采用甲醇將替硝唑稀釋至質(zhì)量濃度為1.0 μg·mL－1的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.1.3 質(zhì)控樣品配制 分別精密量取“2.1.1”項下質(zhì)控溶液 50 μL，氮氣吹干，加入空白人血漿50 μL，渦旋2 min，制成高、中、低3 個濃度的質(zhì)控樣品。

2.2 色譜和質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 采用Waters C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相A 為0.1%甲酸水溶液，B 為乙腈溶液，梯度洗脫（0 →0.5 min，10%B；0.5 →3.0 min，10%→ 90%B；3.0 →4.0 min，90%B；4.0→4.5 min，90%→10%B；4.5→5.0 min，90%B）；流速為0.3 mL·min－1；柱溫為40℃；進(jìn)樣體積為5 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源，正離子掃描方式，多反應(yīng)監(jiān)測模式，脫溶劑溫度為400℃，脫溶劑氣流速為800 L·h－1，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，化合物質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

表1 5 種化合物和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜檢測參數(shù)Tab 1 Mass parameters of 5 compounds and internal standard

2.3 血漿樣品處理

取50 μL 血漿，加入50 μL 內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋30s，加入150 μL 甲醇，渦旋2 min，14 000 r·min－1離心10 min，取上清液100 μL，加入900 μL 初始流動相，渦旋2 min，取5 μL 進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 取6 份不同來源的空白人血漿，加入“2.1.1”項下混合對照品質(zhì)控溶液，并將空白血漿、空白血漿＋質(zhì)控溶液按照“2.3”項下方法處理后進(jìn)樣。結(jié)果顯示，不同來源的空白血清在相應(yīng)色譜峰保留時間內(nèi)均無干擾峰，方法特異性良好，各化合物色譜圖見圖1。

圖1 各成分及內(nèi)標(biāo)色譜圖Fig 1 Multiple reactin monitoring chromatograms of compounds and the internal standards

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 取50 μL 空白血漿，分別加入50 μL “2.1.1”項下混合對照品梯度溶液和50 μL 內(nèi)標(biāo)工作液，按“2.3”項下條件處理，取5 μL 進(jìn)樣。以待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積比（Y）對質(zhì)量濃度（X）作線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 5 種化學(xué)成分的回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)Tab 2 Linear equation，linearity and correlation coefficient of 5 compounds

2.4.3 精密度和準(zhǔn)確度 取高、中、低3 個濃度的質(zhì)控樣品，按照“2.3”項下方法于同日內(nèi)制備質(zhì)控樣品，每個濃度平行制備5 份，連續(xù)制備3 d 并進(jìn)行測定，計算準(zhǔn)確度、日內(nèi)精密度和日間精密度，結(jié)果見表3。

表3 5 種化合物在血漿中的精密度和準(zhǔn)確度(n ＝5)Tab 3 Precision and accuracy of 5 compounds in the plasma (n＝5)

2.4.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 按照“2.3”項下方法分別制備高、中、低3 個濃度的質(zhì)控樣品，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣分析，以對照品和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值作為A1；取空白血漿按照“2.3”項下方法處理后加入3 個濃度的質(zhì)控溶液，使之濃度與A1的理論濃度相同，以對照品和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值作為A2；3 個濃度的質(zhì)控溶液按照樣品前處理方法進(jìn)行處理，使之與A1的理論濃度一致，進(jìn)樣分析，以對照品和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值作為A3。A1/A2比值為提取回收率，A2/A3比值為基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表4。

表4 5 種化合物在血漿中的基質(zhì)效應(yīng)和回收率(n ＝5)Tab 4 Matrix effect and recovery of 5 compounds in the plasma(n ＝5)

2.4.5 穩(wěn)定性 配制高、中、低濃度質(zhì)控樣品，分別考察短期穩(wěn)定性（室溫放置6 h）、進(jìn)樣器中穩(wěn)定性（4℃）、－20 ℃凍融循環(huán)3 次和長期穩(wěn)定性（－20℃放置14 d）。結(jié)果見表5。

表5 5 種化合物在不同條件下的穩(wěn)定性(n ＝5)Tab 5 Stability of 5 compounds at different storage condition (n ＝5)

2.5 臨床應(yīng)用

本研究采用建立的方法測定了2019年6月—2020年6月在本院ICU、血液科、腎病內(nèi)科和呼吸科等病區(qū)中部分侵襲性真菌感染的患者使用抗真菌藥物后體內(nèi)藥物濃度。共收集到56 例樣本（男性25 例，女性31 例），其中伏立康唑32 例，氟康唑10 例，卡泊芬凈14 例。研究結(jié)果顯示，32 例使用伏立康唑治療的患者中谷濃度最小值為0.54 μg·mL－1，最大值為8.91 μg·mL－1，平均谷濃度為（3.84±2.14）μg·mL－1；10 例使用氟康唑治療的患者中谷濃度最小值為5.33 μg·mL－1，最大值為15.21 μg·mL－1， 平均谷濃度為（9.83±3.11）μg·mL－1；14 例使用卡泊芬凈治療的患者中谷濃度最小值為1.58 μg·mL－1，最大值為9.12 μg·mL－1，平均谷濃度為（5.56±2.41）μg·mL－1。從檢測結(jié)果可以看出，3 種抗真菌藥物在嚴(yán)重侵襲性真菌感染的患者中個體藥動學(xué)差異較大，需密切監(jiān)測血藥濃度。

3 討論

隨著抗真菌藥物在臨床中的廣泛應(yīng)用，出現(xiàn)了越來越多耐藥菌以及與抗真菌藥物相關(guān)的不良反應(yīng)[10]。近年來抗真菌藥物PK/PD 研究概念逐漸被應(yīng)用于臨床[11-12]，PK/PD 研究的最終目的是尋找最佳給藥劑量，優(yōu)化給藥方案。抗真菌藥物PK 研究最重要的內(nèi)容是監(jiān)測該類藥物在患者體內(nèi)的藥物濃度，因此建立快速高效的血藥濃度監(jiān)測方法是開展PK/PD 研究的基礎(chǔ)。

抗真菌藥物血藥濃度測定方法有免疫法、色譜法（HPLC）和質(zhì)譜法（MS）。目前，只有伏立康唑能夠采用免疫法進(jìn)行檢測，其他抗真菌藥物尚無商業(yè)試劑盒上市。HPLC 法分析時間較長，操作復(fù)雜。隨著檢測技術(shù)的提高，LC-MS 法在治療抗真菌藥物監(jiān)測中廣泛使用，其特異性高、運行時間短并可以同時測定分析多種化學(xué)結(jié)構(gòu)。本試驗采用UPLC-MS 聯(lián)用技術(shù)能夠在5 min 內(nèi)同時測定5 種常見抗真菌藥物的含量，具有很高的檢測效率；同時本方法只需50 μL 的血漿樣品，樣本需求量少，可提高監(jiān)測的依存性。通過對方法特異性、線性關(guān)系、回收率等方面的驗證，該方法可確保5 種抗真菌藥物濃度的快速準(zhǔn)確檢測。

由于受醫(yī)療機構(gòu)抗菌藥物的品種和品規(guī)限制，本研究中納入的56 樣本中未使用泊沙康唑和伊曲康唑，但這兩種藥物檢測方法的建立對其TDM 的研究同樣具有重要意義。從32 例使用伏立康唑的患者監(jiān)測結(jié)果中可以看出，其體內(nèi)藥動學(xué)個體差異較大。伏立康唑的療效與體內(nèi)藥物濃度具有很強的相關(guān)性，其推薦的治療濃度范圍為1.0 ～5.5 μg·mL－1，濃度過高發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)的可能性大大增加；卡泊芬凈安全性較其他抗真菌藥物高，關(guān)于人體內(nèi)推薦藥物濃度的研究較少，有研究報道卡泊芬凈的血藥谷濃度應(yīng)維持在1 μg·mL－1以上[13]。氟康唑作為上市最早的三唑類抗真菌藥，具有口服和注射兩種給藥途徑，目前不推薦氟康唑進(jìn)行常規(guī)的TDM 監(jiān)測；有研究顯示抗真菌治療時氟康唑血藥谷濃度在10 ～15 μg·mL－1時治療效果較好，同時不良反應(yīng)較少[14]。本試驗發(fā)現(xiàn)，3種抗真菌藥物在嚴(yán)重感染患者中藥物濃度差異較大，可能與患者疾病和合并用藥情況有關(guān)，特別是在嚴(yán)重肝功能受損和低蛋白血癥患者中，其藥物濃度明顯增加。對56 例嚴(yán)重侵襲性真菌感染患者抗菌藥物體內(nèi)藥物濃度結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，在這類人群中開展抗真菌藥物濃度監(jiān)測對提高患者用藥安全和療效具有很好的促進(jìn)作用。