HPLC-Q-TOF-MS/MS法分析防己茯苓湯的化學成分

劉楊，楊玉佩，沈冰冰2，*（1.湖南省藥品檢驗研究院，長沙 410001；2.湖南省中醫(yī)藥研究院 中藥研究所，長沙41001；.湖南中醫(yī)藥大學，長沙 410208）

防己茯苓湯是由防己、黃芪、桂枝、茯苓和甘草五味中藥組成，來源于《金匱要略》中的水氣病脈證篇，具有益氣健脾、溫陽利水之功效。現(xiàn)代臨床主要用于治療由脾心陽虛濕盛所致之水腫、慢性充血性心力衰竭、尿毒癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[1-3]；也有在此方基礎(chǔ)上進行加減味的復方，用于治療腎病綜合征、乳腺癌、帕金森等疾病[4-5]。但是有關(guān)復方防己茯苓湯全成分的化學分析報道較少，因此采用現(xiàn)代中藥分析技術(shù)手段對其開展化學成分的研究迫在眉睫。其中，HPLC-Q-TOFMS/MS 具有高分辨、高靈敏度等特點，可快速獲得目標物的分子離子峰和特征碎片離子，從而對復方中不同類型的化合物進行定性分析[6-7]。本研究首次采用HPLC-Q-TOF-MS/MS 對防己茯苓湯的化學成分進行分析與鑒定，以期為復方的質(zhì)量控制以及藥效物質(zhì)的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290 infinity 超高效液相色譜儀、Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF-LC-MS/MS 質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；Mettler Toledo AL204 型電子天平、Mettler Toledo XPE105 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），KM-500DB 型中文液晶臺式超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

乙腈色譜純（德國Merck 公司），甲酸[色譜純，阿拉丁試劑（上海）有限公司]，水為純凈水[華潤怡寶飲料（中國）有限公司]，其余試劑均為分析純。中藥材防己、黃芪、桂枝、茯苓和甘草均購自湖南省自然堂中藥飲片有限公司，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所助理研究員沈冰冰鑒定為防己科植物粉防己Stephania tetrandraS.Moore 的干燥根，豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 的干燥根，樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl 的干燥嫩枝，多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf 的干燥菌核，豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根。粉防己堿（純度≥99.6%，批號：110711-201810）、防己諾林堿（純度≥98.3%，批號：110793-201807）、去甲異波爾定（純度≥96.9%，批號：111825-201201）、黃芪甲苷（純度≥96.9%，批號：110781-201717）、甘草苷（純度≥93.1%，批號：111610-201607）、毛蕊異黃酮苷（純度≥98.1%，批號：111920-201606）（對照品，中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 供試品溶液的制備 按防己茯苓湯處方比例（30∶30∶30∶40∶20）取防己、黃芪、桂枝、茯苓和甘草五味中藥，分別按以下3 種方法進行制備：方法一加水600 mL 煎煮2 h；方法二加75%甲醇600 mL 回流提取2 h；方法三加75%甲醇600 mL 超聲提?。üβ剩?00 W，頻率：40 kHz）30 min。分別提取完成后，過濾，減壓濃縮至適量，定容至100 mL。搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，即可。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱量對照品粉防己堿5.16 mg，防己諾林堿5.23 mg，去甲異波爾定5.05 mg，黃芪甲苷 5.11 mg，甘草苷5.03 mg，毛蕊異黃酮苷5.27 mg，75%甲醇超聲溶解，定容至25 mL 量瓶中。于4℃ 冰箱中避光保存，備用。進樣前過微孔濾膜。

2.2 色譜和質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SBC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相A 為0.1%甲酸水，B 為甲醇，梯度洗脫（0 ～7 min，2%B；7 ～25 min，2% ～30%B；25 ～40 min，30% ～35%B；40 ～48 min，38%B；48 ～60 min，38% ～72%B；60 ～80 min，72%B；80 ～85 min，72% ～100%B）， 進樣量5 μL，流速1.0 mL·min－1，柱后分流檢測，分流比為10∶1；柱溫30℃。

2.2.2 質(zhì)譜條件 離子化方式電噴霧離子化（ESI），在正、負離子模式分別采集，干燥氣溫度320℃，干燥氣體積流量為8.0 L·min－1，鞘氣溫度350℃，毛細管電壓3.5 kV，碎片電壓145 V，碰撞能量分別采用 5、10、20、30、40 eV，質(zhì)量數(shù)范圍為m/z50 ～1200。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同制備方法的對比

對3 種不同制備方法的樣品分別進行HPLCQ-TOF-MS 檢測分析，得到總離子流圖（TIC）如圖1所示。通過對比分析色譜峰的數(shù)目以及制備方法的時間，最終確定采用方法三進行制備。

圖1 3 種不同制備方法的TIC 圖Fig 1 Total ion chromatogram of 3 different preparation methods

3.2 成分鑒定

對方法三得到的防己茯苓湯進一步進行HPLC-Q-TOF-MS/MS 分析，分別得到正負離子模式下的總離子流圖，結(jié)果如圖2所示。結(jié)合對照品裂解規(guī)律以及相關(guān)文獻資料對目標化合物進行分析鑒定，最終確定了36 個化合物，包括7個生物堿類，13 個萜類化合物，11 個黃酮類化合物，見表1。

圖2 防己茯苓湯在正負模式下的TIC 圖Fig 2 Total ion chromatogram of Fangji Fuling decoction in positive ion mode and negative ion mode

表1 防己茯苓湯的化學成分的HPLC-Q-TOF-MS/MS 鑒定Tab 1 Identification of chemical constituents of Fangji Fuling decoction by HPLC-Q-TOF-MS/MS

續(xù)表1

3.2.1 生物堿類 所有生物堿類化合物均來自植物粉防己，主要類型有雙芐基異喹啉類、原小檗堿類和阿樸啡類生物堿等[9]。研究發(fā)現(xiàn)該類化合物只出現(xiàn)在正離子模式下，其中雙芐基異喹啉類是頭對頭雙二苯醚雙芐基四氫異喹啉類，這類成分的結(jié)構(gòu)特征主要是尾部的二苯醚鍵是C-3′與C-4′連接，頭部是C-7 與C-8′連接，其質(zhì)譜裂解特點就是雙芐基的裂解?；衔?0和13 的分子離子峰分別為609.2961[M ＋H]＋、623.3088[M ＋H]＋，雙芐基的丟失生成特征離子m/z381 和m/z395，另外還有m/z190、m/z174、m/z160 等碎片離子的出現(xiàn)，具體裂解規(guī)律如圖3所示。對比對照品，確定化合物分別為粉防己堿和防己諾林堿。

阿樸啡類生物堿根據(jù)N 上是否有甲基，會產(chǎn)生M-43 或M-29 的特征碎片離子峰，并且會出現(xiàn)失去一系列取代基（-OCH3，-CH3，-OH）的離子峰?；衔? 和8 的分子離子峰為342[M ＋H]＋，比較兩者二級質(zhì)譜裂解均出現(xiàn)299[M ＋H-C2H5N]＋，327，324 和310 等碎片離子，如圖4所示。對比文獻和保留時間確定化合物5 和8 分別為異紫堇定堿、紫堇定堿[10]?；衔? 具有和紫堇定堿一致的裂解規(guī)律，只是分子離子峰328.1568[M ＋H]＋相差14 Da，故確定該化合物為波爾定堿或異波爾定堿。而化合物7 產(chǎn)生了N 上沒有甲基的M-29 特征碎片離子，對比對照品，確定化合物為去甲異波爾定。

圖4 紫堇定堿的質(zhì)譜裂解途徑Fig 4 Fragmentation pathway of corydine

3.2.2 三萜類 復方中的三萜主要來源于茯苓、黃芪和甘草。其中，茯苓中的三萜主要是羊毛甾烷型三萜酸，根據(jù)3、4 位是否開環(huán)及碳碳雙鍵的位置主要分為四大類[15]：羊毛甾-8 烯型（Ⅰ型）、羊毛甾-7，9（11）-二烯型（Ⅱ型）、3，4 開環(huán)-羊毛甾-8 烯型（Ⅲ型）和3，4 開環(huán)-羊毛甾-7，9（11）-二烯型（Ⅳ型）。分子離子峰在正負模式下都有較強的響應(yīng)，主要以[M-H]－、[M ＋H]＋等形式存在。在二級質(zhì)譜下，其裂解主要是由于C-3、C-16 和C-17 位上取代基的斷裂引起的，并且3，4 開環(huán)類化合物與C-1 位相連的鍵極易斷裂。化合物24 在ESI（＋）模式下響應(yīng)較高，會丟失碳3、16、17 位上的取代基，生成相應(yīng)的碎片離子峰469[M ＋H-C2H4O2]＋、511[M ＋H-H2O]＋、373[M ＋H-C9H16O2]＋，最終產(chǎn)生m/z295 的Ⅰ型特征離子；而化合物23 和25 產(chǎn)生的是Ⅱ型特征離子m/z293，如圖5所示，對照文獻[16]確定化合物24、23 和25 分別為茯苓酸、去氫茯苓酸和去氫齒孔酸。另外，化合物18，21和22 都屬于Ⅳ型，在ESI（＋）模式下，17 位上的取代基丟失并同時失去一分子H2O 得到Ⅳ型特征離子m/z325，對照文獻[15]確定分別為茯苓新酸 E、茯苓新酸 D 和茯苓新酸 B。

圖5 茯苓Ⅰ型和Ⅱ型三萜的質(zhì)譜裂解途徑Fig 5 Fragmentation pathway of pachymic acid（type I）and dehydropachymic acid（type Ⅱ）

黃芪是一類較特殊的環(huán)阿屯烷型三萜皂苷，與羊毛甾烷型的差別在于C-10 位的甲基和C-9位脫氫形成三元環(huán)[18]?；衔?0 分子離子峰807.4488[M ＋Na]＋會連續(xù)丟失一分子葡萄糖和一分子木糖，形成環(huán)黃芪醇骨架離子437 [M ＋H-Glc-Xyl-3H2O]＋，然后與17 位相連的E 環(huán)會斷裂生成m/z125 特征碎片離子，這與對照品黃芪甲苷的裂解途徑一致。此外，化合物28、33和34 也均產(chǎn)生了m/z437 和m/z125，對照參考文獻[11]和保留時間分別確定為astrasieversianinⅡ、黃芪皂苷 Ⅱ和黃芪皂苷Ⅰ。

甘草中的三萜主要是齊墩果烷型，在ESI（＋）模式下主要以[M ＋Na]＋、[M ＋H]＋形式存在。在二級質(zhì)譜裂解過程中，主要是糖鍵的連續(xù)性斷裂以及取代基的丟失?；衔?9 的分子離子峰為845.3883[M ＋Na]＋，在ESI（＋）模式下會連續(xù)失去兩分子葡萄糖醛酸生成647[M ＋H-C6H8O6]＋和471[M ＋H-C12H16O12]＋， 然后母核的C 環(huán)發(fā)生RDA 裂解， 生成m/z263 和m/z209 兩個特征碎片離子，從而確定化合物為甘草酸。化合物35 和36 的分子離子峰分別為823.4146 [M ＋H]＋和825.4380[M ＋H]＋，也會連續(xù)失去兩個葡萄糖醛酸，得到m/z471 和m/z473 的骨架離子，但其具體取代位置無法確定，對照文獻[12]確定化合物35 和36 為甘草皂苷K2和J2或其異構(gòu)體。

3.2.3 黃酮類 黃芪中的化合物14、17、31 和32 都屬于異黃酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)該類化合物在ESI（＋）模式下豐度較大，出現(xiàn)[M ＋Na]＋和[M ＋H]＋分子離子峰，并且其裂解規(guī)律與黃酮類差別不大，主要是C 環(huán)的RDA 裂解?；衔?4 的分子離子峰469.1093[M ＋Na]＋，失去一分子葡萄糖形成母核285[M ＋H-Glc]＋，然后4′位的-OCH3容易丟失形成m/z255，最后發(fā)生RDA 裂解形成m/z137 的特征碎片例子。其裂解途徑與對照品一致，故確定為毛蕊異黃酮苷。

甘草中的黃酮主要包括黃烷酮類、二氫黃酮類、查爾酮類等類型。黃烷酮類化合物主要是C環(huán)的RDA 裂解和B 環(huán)的斷裂；而二氫黃酮類中A 環(huán)和B 環(huán)間連接的各個鍵都肯可能會裂解，從而產(chǎn)生相應(yīng)的碎片離子。化合物11 在ESI（＋）模式下響應(yīng)較高，發(fā)生RDA 裂解產(chǎn)生m/z137 的特征碎片離子峰，另外還出現(xiàn)257[M ＋H-Glc]＋，163[M ＋H-Glc-C6H6O]＋等離子峰，如圖6所示，通過與甘草苷對照品的裂解途徑對比，確定該化合物為甘草苷。化合物15、19 和20 是甘草苷的同分異構(gòu)體。化合物15 的分子離子峰為441.1148 [M ＋Na]＋，失去一分子葡萄糖[M ＋H-Glc]＋后，A 環(huán)發(fā)生裂解得到二氫黃酮類的特征離子m/z109，對照文獻[14]確定化合物為異甘草苷。根據(jù)極性大小與保留時間，化合物19 與20分別確定為新甘草苷和新異甘草苷?；衔?6 與異甘草苷的裂解規(guī)律一致，僅多了個失去芹糖的離子峰419[M ＋H-Apiose]＋，因此確定該化合物為芹糖異甘草苷。

圖6 甘草中甘草苷的質(zhì)譜裂解途徑Fig 6 Fragmentation pathway of liquiritin

4 討論

本試驗考察了3 種不同制備方法，最終采用75%甲醇超聲提取法，并且首次對防己茯苓湯的化學成分進行HPLC-Q-TOF-MS/MS 快速分析。研究發(fā)現(xiàn)各成分在ESI（＋）模式的響應(yīng)較強，所以本試驗主要針對正模式下的質(zhì)譜裂解規(guī)律進行了分析總結(jié)，最終對比對照品以及相關(guān)參考文獻，共鑒定了36 個化合物，包括7 個生物堿類，13 個萜類化合物，11 個黃酮類化合物。其中，來源于防己的有7 個，茯苓有6 個，黃芪有9 個，甘草有11 個，桂枝有1 個，且大部分化合物都是各自中藥的特征成分。但是來源于桂枝的較少，可能與其主要成分是揮發(fā)油有關(guān)。另外，質(zhì)譜解析過程中也存在大量同分異構(gòu)體，在無對照品的支撐下無法確定，需要其他手段進一步深入研究。本試驗運用HPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)方法，對復方防己茯苓湯的主要化學成分進行了詳細研究，這對復方的質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的進一步研究具有重要意義。