不同抗原修復條件對腸癌MMR蛋白免疫組織化學染色效果的影響

李梅，龍衛(wèi)國，鐘安菁

（江蘇大學附屬醫(yī)院，鎮(zhèn)江212001）

隨著內(nèi)鏡檢查的普及，腸癌的發(fā)病率與檢出率逐年提升，已成為威脅我國國民健康的第三大惡性腫瘤。約有15%的結(jié)直腸癌是由微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）途徑發(fā)生的，而DNA錯配修復（MMR）基因的表達缺失、引起DNA復制過程中錯配積累是MSI發(fā)生的原因[1]。MMR蛋白家族有許多成員，目前發(fā)現(xiàn)且已知對臨床治療有指導意義的主要包括以下4個：PMS2、MSH2、MSH6和MLH1，其常用檢測方法為PCR法和免疫組織化學染色。因后者具有特異性強、敏感性高、快捷、易于推廣等特點，已廣泛應用于臨床病人MSI的篩查。但由于免疫組織化學染色是個多環(huán)節(jié)、多因素影響的技術(shù)，其穩(wěn)定可靠的染色結(jié)果依賴于個性化的優(yōu)秀的染色方案和良好的質(zhì)量控制。對于日常甲醛固定石蠟包埋的組織，其恰當?shù)目乖迯?，更是直接決定實驗的成敗。故筆者結(jié)合本室的實際情況，對50例腸癌標本MMR蛋白采用三種不同的抗原修復條件行免疫組化檢測，探討其最佳的染色條件。

材料與方法

1 材料

收集2018年～2019年經(jīng)病理確診的結(jié)直腸癌手術(shù)根治標本50例，要求入選病例為浸潤癌，不包括原位癌和高級別上皮內(nèi)瘤變。一抗PMS2、MSH2、MSH6、MLH1購于北京中杉（克隆號依次為：EP51、RED2、EP49、ES05）；二抗及顯色劑分別購于徠卡公司和羅氏公司；抗原修復液：檸檬酸緩沖液（pH 6.0）、EDTA緩沖液（pH 9.0）購于北京中杉，CC1緩沖液購于羅氏公司，余下試劑均購于邁新公司；BenchMark XT全自動免疫組織化學染色機購于羅氏公司。

2 方法

50例樣本每例各切片3張，3μm厚，65℃烘片1h。將切片分別以3種不同修復條件進行抗原修復后進行染色。①檸檬酸緩沖液高溫高壓法：切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精至水化、蒸餾水洗；以pH6.0檸檬酸緩沖液121℃高壓，噴氣計時2min，室溫5min，自來水沖淋高壓鍋外壁，直至室溫；PBS（pH7.2～7.4）洗2min×3次； 3%雙氧水室溫孵育10min，去除組織內(nèi)源性過氧化物酶；非免疫羊血清室溫孵育20min，降低非特異性染色；甩去血清，每張切片滴加100μl一抗，4℃過夜；取出切片，室溫放置20min，使組織恢復至常溫，PBS沖洗，2min×3次；每張切片滴加100μl二抗，室溫孵育20min，PBS沖洗，2min×3次；DAB顯色，室溫5min；自來水沖洗，蘇木精復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。②EDTA高溫高壓法：二甲苯脫蠟、梯度酒精至水化，蒸餾水洗；以pH9.0 EDTA緩沖液121℃高壓，噴氣計時2min，室溫5min，自來水沖淋高壓鍋外壁，直至室溫；余下操作同檸檬酸高溫高壓法。③CC1緩沖液BenchMark XT機法： pH8.5 CC1修復液100℃ 60min；一抗37℃孵育32min；二抗HRP-Multimer 37℃ 孵育8min；DAB顯色37℃ 8min；蘇木精復染，清潔切片，脫水透明封固。

結(jié) 果

MMR蛋白表達于腫瘤細胞的細胞核，其陽性對照可選用組織自身的內(nèi)對照，即正常腸粘膜上皮細胞、淋巴細胞、腫瘤間質(zhì)細胞等（核陽性著色）。

50例腸癌標本分別用不同抗原修復條件進行免疫組織化學染色后發(fā)現(xiàn)：44例標本中，在內(nèi)對照均存在的情況下，3種抗原修復條件下的腫瘤細胞均表達MMR蛋白，但陽性強度從BenchMark XT機法、檸檬酸緩沖液高溫高壓法和EDTA緩沖液高溫高壓法依次增強，陽性數(shù)依次增多（圖A1—A3）；4例出現(xiàn)PMS2或（和）MLH1表達缺失，判為MSI-H；1例MSH2使用BenchMark XT機法出現(xiàn)假陰性（圖B1—B3），1例PMS2腫瘤與非腫瘤細胞質(zhì)彌漫性染色，定位錯誤，無法判讀。

討 論

MSI結(jié)直腸癌的篩查不僅具有提示預后、指導治療等臨床意義，而且有助于Lynch綜合征患者的檢出，為患者家族成員的腫瘤預防提供重要信息。PCR方法檢測腫瘤MSI狀態(tài)作為最早確立的鑒別MSI結(jié)直腸癌的分子手段[2]，雖然具有很高的敏感性，但其費用較高，且需要一定的組織量。相比之下，使用免疫組化法檢測具有經(jīng)濟、便利、穩(wěn)定，所需組織量少，活檢標本亦可檢測，且檢測結(jié)果與切除標本檢測結(jié)果一致[3]，能夠為癌癥晚期，不宜手術(shù)的患者在進行新輔助治療前提供指導方向。另外，通過4種MMR蛋白的免疫組織化學染色結(jié)果觀察，可以直接提示發(fā)生錯配修復蛋白的類型，為Lynch綜合征的確診明確指向。但是，免疫組織化學染色結(jié)果受組織固定、染色條件、抗體克隆號不同等因素的影響[4]，不同實驗室間易造成一定的偏差。為此，本人結(jié)合科室現(xiàn)狀，對染色條件中的抗原修復這一影響因素進行比較分析，以優(yōu)化出適合本室的MMR蛋白檢測條件。

恰當?shù)目乖迯褪敲庖呓M織化學染色成功的重要前提。自20世紀90年代開始，抗原修復技術(shù)得以長足發(fā)展和廣泛應用，數(shù)百種蛋白得以在福爾馬林固定，石蠟包埋的組織中表達，為科學家們進行回顧性研究提供了可能。福爾馬林屬于交聯(lián)性固定劑，可以造成蛋白質(zhì)的交聯(lián)，即在氨基酸分子間形成亞甲基橋，從而造成部分或大部分抗原結(jié)合位點的封閉。在進行免疫組織化學染色時，則需要斷開醛鍵，打開蛋白之間的交聯(lián)，重新暴露出抗原決定簇，以利于抗體的結(jié)合。目前常用的抗原修復方法有酶修復和熱修復兩種，后者因操作簡便，適用于大多數(shù)抗原，被廣泛使用。

影響抗原熱修復的主要因素有：修復液的pH值、修復溫度和修復時間。①當修復時間一定時，修復液的pH值是影響抗原修復效果的重要因素。修復液的pH值應根據(jù)抗體性質(zhì)選擇，有些抗體如CD20、CK(pan)等對修復液的pH無嚴格要求，在酸性和堿性修復條件下均可良好表達；而cyclin D1、HMB45等部分抗體，修復效果則隨pH值增加而逐漸上升，更適宜用堿性的修復液。從本實驗結(jié)果可以看出，MMR蛋白顯然屬于后者，同為高溫高壓修復，時間均為噴氣計時2min，且其余染色操作完全一致的情況下，應用pH 9.0 的EDTA緩沖液修復的切片，染色效果更優(yōu)于pH 6.0 檸檬酸緩沖液修復的切片。原因可能是EDTA與組織中的Ca2+形成螯合劑，可消除甲醛固定產(chǎn)生的不利因素[5]。②當選擇相同或相近pH值的修復液時，修復溫度和時間不同，其染色效果也相去甚遠。在BenchMarkXT機染法與EDTA緩沖液高溫高壓法的比較中，其修復液pH值分別為8.5和9.0，酸堿度十分接近，但因為修復的溫度和時間不同，最終應用EDTA緩沖液高溫高壓法修復的染色效果明顯優(yōu)于BenchMarkXT機染法。筆者認為，這是因為機器在通過加熱塊給組織修復時，溫度一般在98℃～100℃，不能達到高壓鍋內(nèi)的121℃，致使抗原暴露不充分。雖然BenchMarkXT染機法的熱修復時間有60min，而EDTA緩沖液高溫高壓法修復時間僅僅為噴氣計時2min，但是對于一些較難表達的核抗原，其修復溫度影響更明顯，原因可能是MMR蛋白對加熱溫度較為敏感，高溫高壓更有利于醛鍵的斷裂，蛋白交聯(lián)的打開，組織內(nèi)抗原決定簇的充分暴露?？梢?，在抗原修復這一環(huán)節(jié)上，不同的修復液、不同的修復溫度、不同的修復時間都會對最終的染色結(jié)果產(chǎn)生較大影響，有針對性地改善抗原修復條件，可以大大改善相關(guān)抗原的陽性表達效果，明顯降低假陰性的概率[6]。

圖1 不同抗原修復條件對MMR蛋白免疫組織化學染色效果影響的比較。A，MSH6免疫組織化學染色：A1，BenchMarkXT機法，腫瘤細胞弱到中等強度陽性，周邊間質(zhì)細胞弱陽性染色；A2，檸檬酸緩沖液高溫高壓法，腫瘤細胞、間質(zhì)細胞及淋巴細胞均有中等程度的陽性表達；A3，EDTA緩沖液高溫高壓法，腫瘤細胞彌漫強陽性，內(nèi)對照陰性，對比清晰。B，MSH2免疫組織化學染色：B1，BenchMarkXT機法，腫瘤細胞與內(nèi)對照正常黏膜基底細胞、間質(zhì)細胞均陰性；B2，檸檬酸緩沖液高溫高壓法，腫瘤細胞及周邊正常腺體弱陽性；B3，EDTA緩沖液高溫高壓法：腫瘤細胞彌漫陽性，且信號強度明顯優(yōu)于檸檬酸緩沖液高溫高壓法染色，基底部正常腺體強陽。比例尺，20μmFig.1 Comparison of the effects of different antigenic retrieval conditions on the immunohistochemical staining results of MMR protein. A, immunohistochemical staining of MSH6: A1, tumor cells were weakly to moderately positive and peripheral stromal cells were weakly positive in sections treated with the BenchMarkXT machine method; A2, tumor cells, mesenchymal cells and lymphocytes were all moderately positive in sections treated with the citric acid buffer high-temperature and high-pressure method; A3, the tumor cells were diffusely and strongly positive and the internal control was negative in sections treated with the EDTA buffer high-temperature and high-pressure method, and the contrast was clear. B, immunohistochemical staining of MSH2: B1, tumor cells, normal mucosal basal cells and interstitial cells were negative in sections treated with the BenchMarkXT machine method;B2, tumor cells and surrounding normal glands were weakly positive in sections treated with the citric acid buffer high-temperature and high-pressure method; B3, tumor cells were diffusely positive in sections treated with EDTA buffer high-temperature and high-pressure method, and the signal intensity was stronger than that in sections treated with the citric acid buffer high-temperature and high-pressure method, and the normal glands at the base were strongly positive. Scale bar, 20μm

在腸癌MMR蛋白檢測時，還應重視組織內(nèi)對照：只有當內(nèi)對照（腫瘤間質(zhì)細胞、腸黏膜上皮細胞、淋巴細胞等）細胞核陽性而癌細胞全陰時，方能表明該蛋白缺失。當內(nèi)對照陰性或著色明顯低于腫瘤細胞時，結(jié)果難以判讀，此時，可以嘗試更換抗原修復條件，重新復做，避免因抗原暴露不充分而誤判。特別是在全自動免疫組織化學染色儀廣泛使用的今天，機染雖以高效、穩(wěn)定、可重復性高等優(yōu)點，為病理技術(shù)的標準化提供了基礎，但是，在帶來便利的同時，也迎來了新的挑戰(zhàn)，如程序的設定、抗原修復液及修復溫度的選擇等。一般機器染色只支持一種pH的抗原修液，修復的溫度最高為100℃，雖能滿足大部分抗原的需要，但仍有些抗原因暴露不足，導致結(jié)果出現(xiàn)假陰性。本實驗中出現(xiàn)的1例MSH2假陰性可能與此相關(guān)。

檢測MMR蛋白表達情況通?？捎行У胤从衬[瘤MSI狀態(tài)[7]，而只有從影響染色的多重因素著手，建立起適合本科室的個性化的染色條件，豐富病理醫(yī)生的判讀經(jīng)驗，減少各個環(huán)節(jié)的主觀人為因素，才能為患者提供可靠的檢測結(jié)果。同時，現(xiàn)階段明確的四種PMS2、MSH2、MSH6和MLH1基因編碼的蛋白只占MMR蛋白的大多數(shù)，尚有其它類型導致錯配修復蛋白表達缺失的MMR基因有待于進一步探索。