基于免疫組織化學(xué)、組織芯片和RNA測序數(shù)據(jù)分析MACC1在結(jié)直腸癌的臨床病理學(xué)意義

吳共發(fā)，邱麗湞，劉海盛，曾宇婷，黃綺亭，曾煉坤，徐潤強(qiáng)，李海剛,6*

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院1病理科，2健康管理中心，3麻醉科，4內(nèi)三科，5普外科，廣州 511300；6中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院病理科，廣州 510120）

結(jié)直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是全世界病死率居第3位的惡性腫瘤[1]。在我國，CRC發(fā)病率逐年提高，已居惡性腫瘤第3位[2]。迄今CRC的治療以外科手術(shù)為主，結(jié)合放化療及靶向治療等方法，但其根治術(shù)的5年生存率僅約50%，侵襲和轉(zhuǎn)移仍是死亡的主要原因[1]。因此，利用生物大數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)并研究與CRC關(guān)系密切的新型分子標(biāo)志物，對于提高疾病早期診斷、患者生存率及臨床治療效果具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因-1（metastasis-associated in colon cancer-1, MACC1）是2009年被證實(shí)的一個與CRC轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因[3]，有望為CRC分子靶向治療提供新靶點(diǎn)。目前國內(nèi)外針對MACC1在CRC中的相關(guān)研究均有報(bào)道，但MACC1在CRC發(fā)生、發(fā)展以及作為治療靶點(diǎn)的相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明。Human Protein Atlas(HPA)數(shù)據(jù)庫是一個巨大的基于RNA測序和免疫組化分析的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，在蛋白表達(dá)分析上具有重要價值[4]。Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA)數(shù)據(jù)庫是在腫瘤基因圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）與基因型-組織表達(dá)（the genotype-tissue expression，GTEx）這兩大著名轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上建立的可視化癌癥大數(shù)據(jù)分析平臺[5]。本研究通過免疫組織化學(xué)檢測CRC中的表達(dá)并結(jié)合挖掘HPA與GEPIA 兩大數(shù)據(jù)庫中相關(guān)信息，分析MACC1的蛋白和mRNA在CRC組織中的表達(dá)差異、與CRC發(fā)病密切相關(guān)分子的關(guān)系以及與臨床病理特征分期和預(yù)后的關(guān)系，為進(jìn)一步研究MACC1基因在CRC中的作用機(jī)制提供線索與思路。

材料與方法

1 臨床資料

選取廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院病理科庫存的2015年3月至2017年12月手術(shù)切除的77例大腸癌及癌旁石蠟組織，均經(jīng)過4%中性甲醛固定及石蠟包埋。所有病例均有完整的臨床資料并且經(jīng)過病理診斷證實(shí)。結(jié)直腸癌的病理診斷根據(jù)WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)第5版，臨床分期參照美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）第八版分期。所有病例術(shù)前未經(jīng)放化療。

2 試劑

兔多克隆濃縮型抗體MACC1（ab106579）購自英國Abcam公司。即用快捷型免疫組織化學(xué)MaxVisionTMHRP (Mouse/Rabbit)檢測試劑盒（KIT-5002）、檸檬酸鹽抗原修復(fù)液、抗體稀釋液、PBS緩沖液和DAB顯色劑均購自福州邁新公司。

3 免疫組織化學(xué)

石蠟組織塊4μm厚切片，防脫玻片撈片，烤箱70℃烤片30min，常規(guī)脫蠟至水后按免疫組化檢測試劑盒說明書操作，采用檸檬酸鹽修復(fù)液在高壓鍋熱修復(fù)3min，自然冷卻后PBS 漂洗5min×3，切片完全浸泡在醫(yī)用雙氧水中10min，PBS 漂洗5min×3；加入一抗（MACC1按1:1500稀釋使用），37℃孵箱1h，PBS 漂洗5min×3，加入二抗，37℃孵箱20min，PBS漂洗5min×3； DAB 顯色，顯微鏡下控色，自來水終止DAB，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，70℃烤片30min，干片后中性樹脂封固。PBS取代一抗作陰性對照，以人肝組織為陽性對照。免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷按照文獻(xiàn)[6]。

4 HPA數(shù)據(jù)庫分析

應(yīng)用HPA數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/）驗(yàn)證MACC1在結(jié)直腸癌中的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究采用該數(shù)據(jù)庫中的44例結(jié)直腸癌組織芯片的81個有效位點(diǎn)的MACC1表達(dá)情況。同時采用HPA數(shù)據(jù)庫中分析基于579例結(jié)直腸癌組織的MACC1 mRNA表達(dá)水平與患者生存預(yù)后的關(guān)系。

5 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析

GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）是由北京大學(xué)研制開發(fā)的用于整合分析癌癥表達(dá)譜數(shù)據(jù)的交互式web服務(wù)器，包含來自TCGA 和GTEx的33種惡性腫瘤9736個腫瘤樣本和8587個正常樣本的RNA測序表達(dá)數(shù)據(jù)[5]。在本研究中使用GEPIA數(shù)據(jù)庫中的“Expression on Box Plots”模塊驗(yàn)證之前免疫組化實(shí)驗(yàn)及HPA數(shù)據(jù)庫所得出的相關(guān)結(jié)果，應(yīng)用“Pathological Stage Plot”和“Survival Plots”模塊進(jìn)一步分析MACC1基因與CRC臨床分期及生存預(yù)后之間的關(guān)系。然后通過“Correlation Analysis”模塊闡明MACC1基因與CRC發(fā)生關(guān)系密切的錯配修復(fù)基因表達(dá)的相關(guān)性。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，77例結(jié)直腸癌的免疫組化實(shí)驗(yàn)所得計(jì)量資料采用Pearson Chi-Square Test，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 結(jié)直腸癌組織高表達(dá)MACC1

MACC1免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物表達(dá)于CRC組織的細(xì)胞質(zhì)，部分癌細(xì)胞核也有表達(dá)，癌組織周圍的纖維間質(zhì)也可見陽性表達(dá)（圖1），MACC1在CRC組織的陽性表達(dá)率75.32%（58/77）。MACC1在癌旁正常黏膜組織中大部分呈陰性表達(dá)，陽性表達(dá)率11.69%（9/77）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示MACC1在CRC組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常黏膜（χ2=65.83,P=0.00）。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測MACC1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)。A，MACC1在正常腸黏膜呈陰性表達(dá)；B，MACC1在結(jié)直腸癌呈陽性表達(dá)，比例尺，50μmFig. 1 Immunohistochemical detection of the MACC1 expression in CRC. A, negative expression of MACC1 in adjacent normal mucosa; B, positive expression of MACC1 in CRC; scale bar, 50μm

2 MACC1與CRC臨床病理特征的關(guān)系

對MACC1與CRC臨床病理特征的關(guān)系分析顯示（表1）：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例癌組織中的MACC1陽性表達(dá)率分別為97.30%和55.00%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.50,P=0.00）。在有神經(jīng)侵犯和無神經(jīng)侵犯病例癌組織中的MACC1陽性率為100%和60.42%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.24,P=0.00）。臨床分期Ⅲ期病例癌組織的MACC1陽性表達(dá)率為90%，明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期的60.00%和55.00%（χ2=20.11,P=0.00）。MACC1與患者年齡、性別、組織學(xué)分級、腫瘤大小、浸潤深度和腫瘤部位均無關(guān)（表1）。

表1 MACC1表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between the MACC1 expression and the clinicopathological features of CRC

3 公共數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌組織的MACC1表達(dá)

HPA數(shù)據(jù)庫分析顯示，44例結(jié)直腸癌組織芯片的81個有效位點(diǎn)的MACC強(qiáng)、中、弱陽性表達(dá)分別是25例、18例和1例（圖2A）。GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示275例結(jié)腸癌和92例直腸癌組織中的MACC1 mRNA水平均明顯高于相應(yīng)的正常腸黏膜組織（圖2B）。

圖2 不同公共數(shù)據(jù)庫中MACC1在結(jié)直腸癌的表達(dá)。A，HPA數(shù)據(jù)庫中MACC1在結(jié)直腸癌組織和正常組織中的表達(dá)。B, GEPIA數(shù)據(jù)庫中MACC1 mRNA在MACC1在結(jié)直腸癌組織和正常組織中的表達(dá)； COAD，結(jié)腸癌；READ，直腸癌；*P<0.001Fig. 2 Expression data of MACC1 in CRC from different Public databases. A, expression data of MACC1 in CRC tissues and normal tissues from the HPA database. B, expression data of MACC1 mRNA in CRC tissues and normal tissues from the GEPIA database; COAD, colon cancer; READ, rectal cancer; *P<0.001

4 公共數(shù)據(jù)庫中MACC1在結(jié)直腸癌臨床分期和預(yù)后中的意義

在GEPIA中分析MACC1表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理分期的關(guān)系，顯示在不同的腫瘤臨床分期各組間MACC1 mRNA 表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.29，P=0.0209）（圖3A）。GEPIA數(shù)據(jù)庫生存分析功能顯示，MACC1高表達(dá)組的結(jié)直腸癌患者總生存率與無病生存率均明顯低于低表達(dá)組（均0.01

圖3 GEPIA數(shù)據(jù)庫中MACC1與結(jié)直腸癌臨床分期及患者預(yù)后的關(guān)系。A，GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析顯示MACC1表達(dá)和結(jié)直腸癌患者臨床分期密切相關(guān)(小提琴圖，單向方差分析，0.01

圖4 HPA數(shù)據(jù)庫的生存分析顯示低表達(dá)MACC1 mRNA的結(jié)直腸癌患者預(yù)后比高表達(dá)MACC1的患者好Fig. 4 Survival analysis with data from the HPA database indicated that CRC patients with lower MACC1 expression had a better prognosis than those with higher MACC1 expression

5 MACC1基因表達(dá)量與錯配修復(fù)基因表達(dá)的相關(guān)性

應(yīng)用GEPIA數(shù)據(jù)庫中“Correlation Analysis”功能，分析MACC1基因表達(dá)情況與錯配修復(fù)基因MSH2、MSH6、MLH1和PMS2相關(guān)性情況，發(fā)現(xiàn)MACC1與上述基因的表達(dá)呈現(xiàn)顯著相關(guān)性（均P＜0.01，圖5）。

圖5 來自GEPIA數(shù)據(jù)庫的分析顯示結(jié)直腸癌中MACC1基因表達(dá)與錯配修復(fù)基因（MSH2、 MSH6、MLH1、PMS2）表達(dá)具有顯著相關(guān)性Fig. 5 Data from the GEPIA database showed the expression of the MACC1 gene was significantly correlated with the expression of mismatch repair genes MSH2, MSH6, MLH1, and PMS2

討 論

MACCl基因定位于人類染色體（7p21.1），在2009年由Stein等在結(jié)腸癌患者中首先發(fā)現(xiàn)[3]。隨后大量基因和蛋白質(zhì)組學(xué)層面的研究證實(shí)MACC1在多種實(shí)體惡性腫瘤如結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌等組織中異常高表達(dá)，且與腫瘤臨床分期、遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移、患者預(yù)后等密切相關(guān)，具有作為惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后判斷的獨(dú)立指標(biāo)價值，能為基因治療提供新靶點(diǎn)[7,8]。MACC1在CRC中已有較多研究[9-13]，可以肯定的是，MACC1在CRC中的異常高表達(dá)在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移、預(yù)后等發(fā)揮重要作用，可以作為CRC轉(zhuǎn)移、預(yù)后等的預(yù)測和標(biāo)志物的作用，是CRC新的治療靶點(diǎn)。本項(xiàng)目組前期[6,9]及本實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)了MACC1在77例CRC中的表達(dá)及臨床病理意義，MACC1在CRC組織中的異常高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯和臨床分期有關(guān)。為了進(jìn)一步深入研究MACC1在CRC中的作用機(jī)制及價值，結(jié)合自身初步研究并利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行大數(shù)據(jù)挖掘，以達(dá)到有效利用已有信息資源，降低科研成本，縮短科研周期的目的。

HPA數(shù)據(jù)庫提供24000種人類蛋白質(zhì)的組織和細(xì)胞分布信息，是一個大規(guī)模蛋白質(zhì)研究項(xiàng)目，免費(fèi)提供給公眾查詢。該數(shù)據(jù)庫繪制人體組織和細(xì)胞中表達(dá)基因編碼的蛋白位置，可提供直觀可視化的結(jié)果，便于分析統(tǒng)計(jì)，為發(fā)現(xiàn)腫瘤新的生物標(biāo)記物和新的治療靶點(diǎn)提供有力的證據(jù)支持[14]。本研究首先通過該數(shù)據(jù)庫的組織芯片免疫組織化學(xué)證實(shí)MACC1在CRC表達(dá)異常增加，這也驗(yàn)證了本研究免疫組織化學(xué)結(jié)果的可靠性。該數(shù)據(jù)庫597例CRC患者中高表達(dá)MACC1 mRNA的256名患者生存預(yù)后差，彌補(bǔ)了本研究病例缺乏生存預(yù)后資料的不足。

運(yùn)用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示MACC1 mRNA在367例的CRC樣本中表達(dá)明顯高于667例正常樣本，不同臨床分期間的MACC1表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生存分析顯示高表達(dá)MACC1的CRC患者的總生存率和無病生存率均明顯少于低表達(dá)MACC1的患者。這些結(jié)果證實(shí)MACC1在CRC中的異常高表達(dá)，對腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后發(fā)揮了重要促進(jìn)作用。CRC的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，主要涉及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和染色體不穩(wěn)定性[15]。其中錯配修復(fù)系統(tǒng)的功能減弱甚至缺失會導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定，目前已經(jīng)證實(shí)錯配修復(fù)基因家族成員MLH1、MSH2、MSH6和PMS2在CRC發(fā)生演進(jìn)中起重要作用[16,17]。本研究利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫的基因相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)MACC1基因與錯配修復(fù)家族中的4種重要基因MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表達(dá)具有顯著相關(guān)性，進(jìn)一步證實(shí)MACC1基因在CRC發(fā)病過程中發(fā)揮重要促癌作用。

綜上所述，本研究在自身免疫組織化學(xué)研究基礎(chǔ)上，結(jié)合HPA數(shù)據(jù)庫和GEPIA數(shù)據(jù)庫的大數(shù)據(jù)挖掘分析結(jié)果，避免了研究樣本量過小及資料不全等不足所產(chǎn)生的誤差，準(zhǔn)確地分析并證實(shí)了MACC1的異常表達(dá)增高在CRC的發(fā)生和進(jìn)展上具有重要作用。下一步，本研究會深入研究MACC1在CRC中的作用機(jī)制，有望為臨床尋找判斷侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后的標(biāo)記物乃至治療靶點(diǎn)。