超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞組織中利巴韋林殘留

◎ 馬 凱，楊春萍，楊昌彪，黃永橋，吳新文

（1.貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽 550000；2.貴州省檢測技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州 貴陽 550000）

利巴韋林又名病毒唑、三氮唑核苷、尼斯可等[1]，是廣譜強(qiáng)效的抗病毒藥物，在人類流感類疾病防治領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，但部分養(yǎng)殖戶將其違規(guī)用于畜禽疫病防治，若長期大量使用會導(dǎo)致流感病毒變異，為動物疫病甚至人類流感類疫病的防治帶來不確定性。此外，畜禽食品中藥物的殘留會通過食物鏈進(jìn)入人體，長期累積后會產(chǎn)生神經(jīng)毒性，直接誘導(dǎo)人類流感病毒產(chǎn)生變異及耐藥性增強(qiáng)，威脅到人類健康。美國食品藥品管理局（FDA）于2005年開始禁止利巴韋林等抗病毒藥物用于畜禽類養(yǎng)殖；我國農(nóng)業(yè)部公告第560號中將利巴韋林列入了獸藥禁止使用的范疇[2]，2021年利巴韋林成為國家食品安全監(jiān)督抽檢的重要項目。

目前，利巴韋林的檢測方法有放射免疫法[3]、高效液相色譜法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法[5]、液相色譜-質(zhì)譜法[6-8]等，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，選擇性好，驗證性能可靠，是測定該藥物殘留的理想方法。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（(UPLC-MS/MS）測定雞組織中利巴韋林殘留量，并對前處理方法和儀器分析條件進(jìn)行優(yōu)化，為禽類養(yǎng)殖業(yè)中利巴韋林殘留量的監(jiān)控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1290/6460超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）、GZ-250S恒溫培養(yǎng)箱（韶關(guān)市廣智科技設(shè)備發(fā)展有限公司）、HT150R型高速冷凍離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、UMV-2多管旋渦混合器（北京普立泰科儀器有限公司）、Milli-Q實驗室超純水制備系統(tǒng)（美國Millipore公司）、SHB-Ⅲ型真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、PHS-3C型pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、瓶口分液器（德國普蘭德公司）、12管固相萃取裝置（美國SUPELCO公司）、XW-80A型旋渦混合器（蘇州江東精密儀器有限公司）、電子天平（精確到0.01 g，常熟市雙杰測試儀器廠）、移液器（規(guī)格10～100 μL、100～1 000 μL、1～5 mL，大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

乙腈（色譜純，德國Merck公司）、甲酸（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）、乙酸銨（優(yōu)級純，山東西亞化學(xué)股份有限公司）、三氯乙酸（分析純，成都市科龍化工試劑廠）。

酸性磷酸酶（來源于小麥胚芽，≥0.4 U·mg-1，上海安譜實驗科技股份有限公司）；CNWBOND PBA SPE小柱（100 mg/3 mL，上海安譜實驗科技股份有限公司）；0.22 μm有機(jī)微孔濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）；100 μg·mL-1利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)溶液， 100 μg·mL-1利巴韋林-13C5標(biāo)準(zhǔn)溶液（天津阿爾塔科技有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：準(zhǔn)確移取利巴韋林和利巴韋林-13C5標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇定容至10 mL，分別配制成濃度為10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，4 ℃避光可保存 3個月。

標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制：分別移取利巴韋林和利巴韋林-13C5標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇定容至10 mL，分別配制成濃度為100 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，4 ℃避光可保 存1周。

乙酸銨溶液（pH4.8）：稱取乙酸銨154.0 g，加水約950 mL溶解，用乙酸調(diào)pH至4.8±0.1，加水定容至1 000 mL。

乙酸銨溶液（pH8.5）：稱取乙酸銨18.12 g，加水約950 mL溶解，用氨水調(diào)pH至8.5±0.1，加水定容至1 000 mL。

三氯乙酸溶液（20 g·L-1）：稱取20 g三氯乙酸，加水約950 mL溶解，用氨水調(diào)pH至4.8±0.1，加水定容至1 000 mL。

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB-Aq，2.1 mm× 150 mm，2.7 μm；流動相：A為0.1%甲酸水溶液（含2 mmol·L-1乙酸銨），B為乙腈；流速0.5 mL·min-1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL；梯度洗脫程序：0～1min（2%B），1～2 min（2%～15%B），2～3 min （15%～50%B），3～4 min（50%～95%B），4～6.5 min （95%B）；后運(yùn)行時間：3 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），正離子掃描，毛細(xì)管電壓4 000 V，噴嘴電壓500 V，霧化氣壓力40 psi，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速 8 L·min-1，鞘氣溫度300 ℃，鞘氣流速10 L·min-1，Delta EMV值為500，利巴韋林和利巴韋林-13C5定性、定量離子、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 目標(biāo)物的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)表

1.3.3 樣品前處理

（1）樣品制備。雞肉、肝臟、腎臟等放入組織搗碎機(jī)中充分搗碎混勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為試樣，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，將試樣置于-18 ℃冷凍避光保存。雞蛋樣品中取出有代表性樣品約500 g，去殼后用組織搗碎機(jī)攪拌充分混勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為試樣，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，將試樣置于4 ℃冷藏避光保存。

（2）提取。準(zhǔn)確稱取樣品5 g（精確到0.01 g），置于50 mL具蓋的離心管中，添加100 μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，再加入10 mL乙酸銨緩沖溶液（pH4.8）和100 μL酸性磷酸酶溶液，加入1粒陶瓷均質(zhì)子，于多管旋渦混合器充分提取5 min，然后將樣品置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光酶解2 h，在酶解液中加入8 mL三氯乙酸溶液，渦旋30 s，4 ℃條件下8 000 r·min-1離心5 min，收集上清液于另一離心管中，用20%氨水調(diào)pH至8.5±0.1，加水定容至25 mL，混勻，4 000 r·min-1離心5 min，待凈化。

（3）凈化。取PBA固相萃取小柱，預(yù)先以3 mL乙腈，3 mL 1%甲酸水，3 mL乙酸銨溶液（pH8.5）活化，取5 mL樣品提取液過柱，控制流速小于3 mL·min-1， 依次用3 mL乙酸銨溶液（pH8.5），3 mL水淋洗， 3 mL5%氨水甲醇淋洗，真空抽干2～3 min，以2.0 mL 0.5%甲酸水洗脫，擠干小柱，收集洗脫液，加洗脫液定容至2 mL，旋渦混勻后，過0.22 μm微孔濾膜，使用UPLC/MS/MS進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用內(nèi)標(biāo)法，結(jié)合Agilent MassHunter工作站配置軟件，以定量離子的響應(yīng)峰面積對應(yīng)質(zhì)量濃度作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，對測定結(jié)果進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

利巴韋林的分子結(jié)構(gòu)中含有酰胺結(jié)構(gòu)，在正離子模式下能得到較好的分子離子峰[M+H]+，因此質(zhì)譜方法采用電噴霧正離子模式進(jìn)行掃描。配制100.0 ng·mL-1利巴韋林和利巴韋林-13C5混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，聯(lián)機(jī)液相色譜，對其進(jìn)行碰撞解離，通過子離子掃描，得到利巴韋林碎片離子信息，對錐孔電壓、碰撞能量、鞘氣溫度和流量、干燥氣溫度和流量、霧化器壓力、毛細(xì)管電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選擇響應(yīng)較好的特征離子作為定性定量離子，優(yōu)化后參數(shù)見1.3.2。

2.2 液相色譜條件的選擇

利巴韋林極性較強(qiáng)，在反相色譜柱上幾乎無保留，目前色譜分析方法大多采用親水色譜（HILIC）柱以改善利巴韋林的保留情況。此外，根據(jù)已發(fā)表的相關(guān)研究[9-10]，雞組織樣品中含有一種與利巴韋林相似的物質(zhì)，且具有相同的子離子片段，影響目標(biāo)物的含量測定，需要優(yōu)化色譜條件，實現(xiàn)有效分離。本研究選取了含有薄殼型填料顆粒的Agilent Poroshell 120 SB-Aq色譜柱，在100%水相流動相條件下起始，按照1.3.1的色譜條件進(jìn)行梯度洗脫，色譜圖如圖1所示。選用Agilent Poroshell 120 SB-Aq色譜柱可改善利巴韋林在色譜柱上的保留狀況，實現(xiàn)干擾物與利巴韋林的基線分離，避免定性定量的干擾；因采用正離子模式進(jìn)行掃描，在水相中添加了甲酸和乙酸銨，可促進(jìn)離子化效率，并改善目標(biāo)物的峰形。

圖1 雞肉樣品中利巴韋林的MRM色譜圖

2.3 樣品前處理的選擇

與其他被使用的諸多抗生素獸藥不同，利巴韋林極性較強(qiáng)，不能使用有機(jī)溶劑從動物組織中萃取出來。實驗采用水性緩沖液進(jìn)行提取，同時考慮到需要在酸性條件下進(jìn)行酶解以及沉淀樣品的蛋白，在水性緩沖液中加入三氯乙酸溶液，既促進(jìn)了蛋白的沉淀，又有利于后一步的凈化過程。

實驗采用PBA固相萃取柱，是含有苯硼酸官能團(tuán)的獨(dú)特硅膠基質(zhì)吸附劑，可保留酶解后游離出的利巴韋林，并使用甲醇淋洗去除更多非極性保留雜質(zhì)，在酸性條件下，利巴韋林被洗脫出來。本研究使用酸性條件下的水性洗脫液洗脫利巴韋林，與其他酸性條件下的有機(jī)型洗脫液相比，吸附劑能保留大量的基質(zhì)干擾成分，確保凈化效果更加清潔。此外，本實驗選取的色譜柱更適合在高水相流動相條件下的水性樣品進(jìn)樣。

為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)對最終定量結(jié)果的影響，選用利巴韋林的同位素利巴韋林-13C5作為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制用0.5%甲酸水作為定容溶劑。

2.4 線性范圍與檢出限

用移液器分別移取100 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液 0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、 1.00 mL，置于10 mL容量瓶，向每個容量瓶中加入0.10 mL濃度為100.0 ng·mL-1內(nèi)標(biāo)工作液，用0.5%甲酸水定容至刻度，得到質(zhì)量濃度分別為0.5 ng·mL-1、 1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、8.0 ng·mL-1、 10.0 ng·mL-1以及內(nèi)標(biāo)濃度為1.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按照1.3.1和1.3.2條件進(jìn)行儀器分析，以外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)濃度比值為橫坐標(biāo)。結(jié)果表明，利巴韋林在0.5～10.0 ng·mL-1范圍內(nèi)，線性方程為Y=1.001 1X-0.032 5，R2為0.999 8，線性關(guān)系良好。選取不含目標(biāo)組分的陰性樣品，采用樣品加標(biāo)的方式，按照1.3.3前處理的方法進(jìn)行處理，儀器測定，以定量離子色譜峰的信噪比（S/N）≥3計算方法的檢出限，方法檢出限為0.5 μg·kg-1。

2.5 方法回收率與精密度

選取不同基質(zhì)樣品，分別進(jìn)行3個濃度水平的空白加標(biāo)實驗，計算回收率，每個添加水平進(jìn)行6次平行實驗，按照1.3的實驗條件進(jìn)行樣品前處理和儀器測定，計算目標(biāo)物的平均回收率和精密度。

由表2可以看出，利巴韋林的平均回收率為78.6%～102.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.03%～9.14%，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，能夠滿足雞組織中利巴韋林殘留量的檢測要求。

表2 利巴韋林在不同基質(zhì)中的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表（n=6）

2.6 實際樣品的測定結(jié)果

采用優(yōu)化后方法對本地區(qū)的20份雞組織樣品進(jìn)行檢測分析，結(jié)果表明，所有樣品中均未檢出利巴韋林。

3 結(jié)論

本研究建立了雞組織中利巴韋林的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。雞組織中的利巴韋林經(jīng)三氯乙酸溶液提取后，經(jīng)PBA固相萃取柱凈化，采用反相色譜柱分離，在正離子模式下以多反應(yīng)監(jiān)測模式測定，同位素內(nèi)標(biāo)法定量，通過對方法學(xué)參數(shù)進(jìn)行考察，所建立的方法穩(wěn)定性和重復(fù)性好，適用于雞組織中利巴韋林殘留量的測定。