蝦青素對烏鱧生長、抗氧化和免疫功能的影響

■李美鑫 劉曦瀾 許世峰 祝新茗 李沐陽* 王桂芹

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118）

養(yǎng)殖水環(huán)境中不可避免的會同時出現(xiàn)多種應(yīng)激源。溫度、氨氮、溶氧、鹽度的改變、重金屬污染以及病原微生物入侵都會使養(yǎng)殖動物產(chǎn)生不同程度的應(yīng)激[1-2]。各種應(yīng)激源持續(xù)激活免疫系統(tǒng)，短期的免疫系統(tǒng)活化有助于機(jī)體免疫，但長期持續(xù)的激活免疫系統(tǒng)會引起魚類免疫應(yīng)激并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[3]。炎癥反應(yīng)會促進(jìn)免疫細(xì)胞大量分泌IL-1β，引起下丘腦-垂體-腎間軸（HPI）興奮性增強(qiáng)，持續(xù)釋放糖皮質(zhì)激素，改變機(jī)體的營養(yǎng)代謝[4]。魚類在應(yīng)對內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡通常會做出一系列適應(yīng)性反應(yīng)，包括降低采食、減弱游泳活動，重新分配蛋白質(zhì)和脂肪資源物質(zhì)，將用于生長的部分資源用于合成免疫分子，阻礙了飼料營養(yǎng)的利用及生產(chǎn)性能的最大化發(fā)揮[5-6]。

蝦青素（AST）是一種小分子化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有不飽和的羥基和酮基，是飼料添加劑目錄中唯一允許使用的色素類添加劑[7]。蝦青素在機(jī)體中能與肌紅蛋白結(jié)合，使魚類皮膚和鳥類羽毛呈現(xiàn)出艷麗的色彩，調(diào)控機(jī)體色素的沉積[8]。近年來營養(yǎng)和免疫相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素還可以促進(jìn)動物生長，調(diào)節(jié)動物的非特異性免疫功能[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素與類胡蘿卜家族其他成員相比，具有更強(qiáng)的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過氧化抑制能力，還能保護(hù)DNA核酸分子完整性[11]。近年來，蝦青素的免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域越來越受到重視，然而在水產(chǎn)領(lǐng)域罕見報道。因此，本試驗以特色淡水魚烏鱧為研究對象，基于蝦青素以上幾方面的生物學(xué)功能，進(jìn)一步研究蝦青素對烏鱧生長性能、抗氧化、免疫和血清生化指標(biāo)的影響，為蝦青素作為免疫增強(qiáng)劑合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗魚及試驗設(shè)計

試驗魚在過濾單循環(huán)水體馴化暫養(yǎng)14 d，飼喂基礎(chǔ)飼料。試驗開始，體重接近、狀態(tài)良好的800尾烏鱧[初重為（23.40±0.53）g]，隨機(jī)分成4組（每組5個重復(fù)，每重復(fù)40尾），水溫（26±1）℃，pH（7.1±0.1），溶氧（6.21±0.41）mg/L，每天飽食投喂2次（08:00和16:00），記錄投喂量，仔細(xì)觀察魚的游泳活動狀態(tài)，烏鱧進(jìn)食結(jié)束后吸取水面油膜及水底殘餌，及時調(diào)整投喂量。試驗周期為56 d，取樣前禁食并用MS-222（300 mg/L）麻醉，稱重后每個重復(fù)隨機(jī)取5尾抽取尾靜脈血制備血清，收集組織樣品液氮速凍后轉(zhuǎn)移-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗飼料

參照烏鱧配合飼料標(biāo)準(zhǔn)配制顆粒飼料。參照課題組前期工作，在基礎(chǔ)飼料中添加0、50、100 mg/kg和200 mg/kg蝦青素（購自上海源葉生物科技有限公司），其中不添加蝦青素組（0 mg/kg）為對照組，50、100 mg/kg和200 mg/kg為蝦青素試驗組，飼料配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長性能指標(biāo)

飼養(yǎng)結(jié)束后計算平均增重率（WGR）、特定生長率（SGR）、飼料效率（FE）。

平均增重率（%）=100×[末體重（g）-初始體重（g）]/初始體重（g）

特定生長率（%/d）=100×（ln末體重-ln初始體重）/試驗天數(shù)（d）

飼料效率（FE）=總增重（g）/總攝食量（g）

1.3.2 抗氧化和免疫指標(biāo)

烏鱧血清和肝臟組織（SOD）含量測定采用羥胺法、CAT含量測定采用可見光法、GSH-Px含量測定采用比色法，MDA含量測定采用TBA法，PC含量測定采用比色法。

烏鱧血清和脾臟組織：C3、C4、IgM、LZM含量采用免疫比濁法測定。

烏鱧血清：AST、ALT、堿性磷酸酶（ALP）活性和COR含量測定采用微板法、賴氏法測定，所用試劑購自南京建成生物工程研究所。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步整理后，采用SPSS 20.0單因素方差one-way ANOVA分析試驗數(shù)據(jù)以確定顯著差異，后進(jìn)行Tukey多重比較，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦青素對烏鱧生長及飼料利用的影響（見表2）

表2 蝦青素對烏鱧生長及飼料利用的影響

由表2可知，與對照組相比，日糧添加100 mg/kg和200 mg/kg蝦青素組顯著提高烏鱧平均增重率、特定生長率和飼料效率（P<0.05），日糧添加50 mg/kg蝦青素組對生長性能沒有顯著的影響（P>0.05）。

2.2 蝦青素對烏鱧抗氧化指標(biāo)的影響（見圖1、圖2）

如圖1所示，日糧添加50、100 mg/kg和200 mg/kg蝦青素顯著提高烏鱧血清和肝臟SOD活性（P<0.05），100 mg/kg和200 mg/kg蝦青素組肝臟SOD活性顯著高于其他日糧組（P<0.05）。日糧添加50、100 mg/kg和200 mg/kg蝦青素顯著提高烏鱧血清和肝臟CAT和GSH-Px活性（P<0.05），200 mg/kg蝦青素組血清CAT和GSH-Px活性最高，顯著高于其他日糧組（P<0.05）。

圖1 蝦青素對烏鱧血清和肝臟抗氧化酶活性的影響

蝦青素對烏鱧血清和肝臟MDA和PC的影響見圖2。日糧添加100 mg/kg和200 mg/kg蝦青素顯著降低烏鱧血清和肝臟MDA和PC含量（P<0.05）。

圖2 蝦青素對烏鱧血清和肝臟MDA和PC的影響

2.3 蝦青素對烏鱧免疫指標(biāo)的影響（見圖3）

如圖3所示。日糧添加50、100 mg/kg和200 mg/kg蝦青素顯著提高烏鱧血清和肝臟C3含量（P<0.05），各蝦青素處理組血清和肝臟補(bǔ)體C4差異不顯著（P>0.05）。100 mg/kg和200 mg/kg蝦青素組血清IgM水平顯著提高（P<0.05），各蝦青素處理組肝臟IgM水平?jīng)]有顯著的提高（P>0.05）。100 mg/kg和200 mg/kg蝦青素組烏鱧血清LZM活性顯著提高（P<0.05），日糧添加50、100 mg/kg和200 mg/kg蝦青素顯著提高烏鱧肝臟LZM活性（P<0.05）。

圖3 蝦青素對烏鱧血清和脾臟免疫功能的影響

2.4 蝦青素對烏鱧血清生化指標(biāo)的影響（見圖4）

如圖4所示，與對照組相比，日糧添加50、100 mg/kg和200 mg/kg蝦青素顯著降低烏鱧血清ALT和AST活性（P<0.05）。日糧添加50、100 mg/kg和200 mg/kg蝦青素顯著降低烏鱧血清COR含量（P<0.05），血清中各組ALP差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

3.1 蝦青素對烏鱧生長性能的影響

蝦青素是一種能通過血腦屏障的小分子化合物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中具有很廣闊的應(yīng)用前景。Hélène等[12]早期研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加蝦青素可以縮短日本蝦蛻皮周期并促進(jìn)生長。Xie等[13]研究表明，飼喂蝦青素顯著提高金鯧特定生長率和體增重，提高金鯧生長性能。Li等[14]研究也表明，蝦青素可以顯著提高血鸚鵡的生長速度。Cheng等[15]研究也表明，飼料中添加100、200、400 mg/kg和800 mg/kg蝦青素可不同程度地提高克氏原螯蝦體增重和飼料效率。Jagruthi等[9]研究表明，飼喂50 mg/kg和100 mg/kg蝦青素可以顯著提高鯉的增重率，其中以50 mg/kg試驗組體增重最佳。Liu等[16]研究也表明，飼喂蝦青素顯著提高黃顙魚體增重、特定生長率和飼料效率。Alishahi等[17]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加200 mg/kg蝦青素顯著提高白化奧斯卡魚（Astronotus ocellatus）體增重和特定生長率。Cheng等[18]研究也表明，飼料中添加80～320 mg/kg蝦青素可以提高河豚的體增重和特定生長率。本研究結(jié)果表明，日糧添加100 mg/kg和200 mg/kg蝦青素顯著提高烏鱧生長，而50 mg/kg蝦青素日糧對生長性能沒有顯著提高作用。可見，飼料中添加蝦青素具有促進(jìn)水產(chǎn)動物生長的作用，然而其在水產(chǎn)動物的特定生長率、體增重和飼料效率上的影響也有很大差異，這可能是由于蝦青素來源不同造成魚種間實際需求量的差異。蝦青素提高水產(chǎn)動物生長性能，可能原因包括：①蝦青素通過調(diào)節(jié)魚類HPI，促進(jìn)抑制生長激素（GH）和類胰島素生長因子（IGF）分泌及其受體的表達(dá)。②蝦青素提高腸道消化酶的活性，同時促進(jìn)食欲增加攝食量。

3.2 蝦青素對烏鱧抗氧化指標(biāo)的影響

氧化還原反應(yīng)是魚類維持正常生長必不可少的過程，免疫應(yīng)激會影響正常的氧化還原反應(yīng)，造成自由基蓄積[19]。水產(chǎn)動物肝臟組織易受自由基攻擊產(chǎn)生MDA和PC等大分子過氧化產(chǎn)物[20]。魚類抗氧化系統(tǒng)相比陸生養(yǎng)殖動物低等，同時魚類在水生環(huán)境下同時受到多種來源的應(yīng)激。因此，水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中常需要外源添加抗氧化功能的免疫增強(qiáng)劑來輔助養(yǎng)殖動物緩解組織的氧化損傷。蝦青素是一種天然的提取物，可直接參與自由基和超氧陰離子的清除反應(yīng)[14]。Wang等[8]研究表明，蝦青素可以顯著提高中華絨螯蟹肝胰腺的抗氧化酶SOD和T-AOC的活性。Han等[21]研究表明，飼料中添加蝦青素同樣可以提高三疣梭子蟹抗氧化物質(zhì)如SOD、CAT水平和GSH水平，減少M(fèi)DA含量，調(diào)節(jié)異常的自由基代謝。組織中MDA含量反映脂質(zhì)過氧化情況，同時也是評價機(jī)體氧化損傷最直觀的指標(biāo)。Cheng等[15]研究也表明，飼料中添加蝦青素顯著提高克氏原螯蝦肝胰臟SOD、CAT等抗氧化酶水平。本試驗研究結(jié)果表明，日糧添加蝦青素顯著提高烏鱧血清和肝臟SOD、CAT活性和GSH-Px活性，同時有效降低MDA含量和PC含量。姚金明等[7]研究表明，日糧添加蝦青素顯著提高大鱗副泥鰍腸道CAT、GSH-Px活性和SOD等活性，降低MDA含量，進(jìn)一步從側(cè)面佐證了本試驗結(jié)果。Nrf2是參與機(jī)體氧化還原調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，Xie等[13]研究表明，飼喂蝦青素可活化Nrf2-ARE信號通路，提高金鯧低氧脅迫下肝臟抗氧化酶活性，促進(jìn)機(jī)體抵抗氧化損傷能力。綜上可知，蝦青素可通過以下途徑調(diào)節(jié)魚類抗氧化功能：①提高內(nèi)源酶的活性，抑制MDA生成，保護(hù)脂質(zhì)蛋白大分子。②激活Nrf2-ARE途徑分子，提高動物抗氧化損傷功能。

3.3 蝦青素對烏鱧免疫指標(biāo)的影響

蝦青素在促進(jìn)水產(chǎn)動物抗氧化功能的同時，對免疫功能也有不同程度的促進(jìn)效果[21-22]。作為先天免疫的重要指標(biāo)，溶菌酶和補(bǔ)體廣泛分布在體液中，在防止動物體內(nèi)病原性微生物的黏附和定植方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[23]。蝦青素可以促進(jìn)多種免疫活性物質(zhì)分泌，如IgM、LZM、補(bǔ)體等[24]。IgM主要存在于魚類血液中，能與補(bǔ)體相結(jié)合，通過非特異性免疫反應(yīng)清除病原體[25]。本研究表明，日糧添加蝦青素提高烏鱧血清和肝臟中IgM、C3水平和LZM的水平，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答能力。Cheng等[15]、Liu等[16]和Jagruthi等[9]研究也表明，飼喂蝦青素可以顯著提高克氏原螯蝦、黃顙魚和鯉血清LZM水平和抗體水平、頭腎巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)及嗜水氣單胞菌的抗病性，與本研究結(jié)果基本一致。蝦青素能促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答主要原因可能是由于：①蝦青素可以增強(qiáng)抗體分泌細(xì)胞功能，促進(jìn)溶菌酶等免疫活性物質(zhì)的分泌；②蝦青素可以激活補(bǔ)體系統(tǒng)，補(bǔ)體系統(tǒng)可分泌補(bǔ)體C3增強(qiáng)淋巴免疫細(xì)胞功能，促進(jìn)IgM及其他免疫物質(zhì)的分泌。

3.4 蝦青素對烏鱧血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)在一定程度上可反映魚類應(yīng)激水平，ALT和AST是魚肝臟中重要的氨基轉(zhuǎn)移酶并在肝細(xì)胞受損時進(jìn)入血液，故血中轉(zhuǎn)氨酶水平可在一定程度上反映肝臟健康程度。Cheng等[15]研究表明，飼料中添加蝦青素顯著降低克氏原螯蝦血清ALT和AST水平。魚類免疫應(yīng)激狀態(tài)下，血清中COR水平會快速升高，故COR是衡量魚類應(yīng)激程度的重要指標(biāo)。Liu等[16]研究表明，飼喂蝦青素顯著降低黃顙魚血清COR、葡萄糖和轉(zhuǎn)氨酶含量。本試驗研究表明，飼料中添加蝦青素顯著降低烏鱧血清COR含量及ALT、AST活性，與上述研究結(jié)果基本相符。此外，有研究指出COR的升高會抑制GH和IGF-1的分泌[26-28]。因此，蝦青素促進(jìn)生長性能可能與蝦青素降低血清COR、保證正常的生長相關(guān)激素水平，同時降低血清ALT活性和AST活性、保護(hù)肝臟等重要的營養(yǎng)物質(zhì)代謝器官、維持機(jī)體正常生理功能有關(guān)。綜上所述，日糧添加50～200 mg/kg蝦青素均不同程度地提高了烏鱧生長性能、血清和肝臟抗氧化能力，促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答。