噬菌體在仔豬飼糧中的應(yīng)用研究進(jìn)展

■游金明 彭昕彤 諶 俊 鄒田德 王自蕊

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西省動物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省優(yōu)質(zhì)安全畜禽生產(chǎn)產(chǎn)教融合重點(diǎn)創(chuàng)新中心，江西南昌 330045）

近年來，隨著飼用抗生素使用劑量和時(shí)間的增加，抗生素殘留、耐藥性細(xì)菌甚至超級細(xì)菌的出現(xiàn)，嚴(yán)重威脅著人類健康和生態(tài)環(huán)境。繼歐盟之后，我國在2020年正式實(shí)施促生長類飼料抗生素（中藥類除外）全面禁止使用。隨著抗生素禁令的頒布，尋找并研究合適的抗生素替代品逐漸被世界所關(guān)注[1]。1915年，噬菌體首次在倫敦被發(fā)現(xiàn)，其可在細(xì)菌中繁殖并殺死細(xì)菌。近20年研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體具有特異性強(qiáng)、不易產(chǎn)生抗性和繁殖速度快等特點(diǎn)。早期斷奶仔豬腸道發(fā)育不全、腸道菌群定植不完善，面臨著環(huán)境、營養(yǎng)和飼糧改變、大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌的挑戰(zhàn)，上述因素均會嚴(yán)重威脅斷奶仔豬生長發(fā)育和腸道健康，甚至導(dǎo)致仔豬死亡[2]。研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體可作為替代抗生素使用的一類潛在的“武器”，提高仔豬生長性能，改善仔豬腸道結(jié)構(gòu)，靶向殺滅腸道致病菌，維持腸道微生物區(qū)系平衡。本文從噬菌體對仔豬生長性能、養(yǎng)分消化率、腸道形態(tài)、腸道菌群的影響及噬菌體控制病原菌的可能作用機(jī)制進(jìn)行了綜述，旨在為噬菌體在仔豬飼糧中的研究與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐參考。

1 噬菌體簡介

噬菌體是一種依賴于細(xì)菌的病毒，其可侵襲細(xì)菌、真菌、放線菌和螺旋體等微生物[3]。噬菌體由蛋白質(zhì)外殼和殼內(nèi)遺傳物質(zhì)組成，其遺傳物質(zhì)為DNA或RNA，呈線狀或環(huán)狀，為單鏈或?yàn)殡p鏈[4]。噬菌體是生態(tài)系統(tǒng)中分布最為廣泛的生物，其總數(shù)可達(dá)1030～1032個(gè)[5]。噬菌體是微生物系統(tǒng)中重要組成部分，平均每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中就含有10個(gè)噬菌體[6]。噬菌體主要分為烈性噬菌體和溫和型噬菌體兩類[7]。烈性噬菌體外殼上特異性蛋白識別宿主細(xì)胞后，迅速將自身核酸注入細(xì)菌體內(nèi)，利用細(xì)菌體內(nèi)營養(yǎng)快速進(jìn)行自我復(fù)制和增殖，最終裂解并殺死細(xì)菌[4]。而溫和型噬菌體入侵細(xì)菌細(xì)胞后，并不裂解細(xì)菌，而是將自身遺傳物質(zhì)與細(xì)菌遺傳物質(zhì)整合到一起，并隨宿主菌的復(fù)制而復(fù)制[5]。溫和型噬菌體通常不用作抗生素替代品，用于疾病防控與治療。

噬菌體感染細(xì)菌的過程分為五步：①吸附：噬菌體吸附一般分為三個(gè)過程，即初步接觸、可逆結(jié)合和不可逆結(jié)合[8]，初步接觸是指噬菌體與宿主間的流動并引起二者之間的碰撞；第二個(gè)過程是噬菌體與宿主菌之間可逆結(jié)合，宿主菌表面受體和噬菌體結(jié)合域間的特異性連接有時(shí)是通過酶切介導(dǎo)[8]；第三個(gè)過程是噬菌體構(gòu)象發(fā)生變化，從而有利于其將遺傳物質(zhì)注入宿主菌。②穿入：其可能作用機(jī)制如圖1所示[9]，革蘭氏陽性菌最外層是肽聚糖，內(nèi)溶素作為一種重要的酶，是噬菌體在生命周期循環(huán)即將結(jié)束時(shí)所釋放的，可消化宿主菌細(xì)胞壁中的肽聚糖，裂解酶也可降解肽聚糖，使噬菌體能到達(dá)細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜，從而有助于遺傳物質(zhì)注入宿主細(xì)胞；革蘭氏陰性菌有一層結(jié)構(gòu)復(fù)雜且高度不透水的外膜，解聚酶是噬菌體編碼的蛋白質(zhì)，具有類聚糖酶活性，可消化細(xì)菌細(xì)胞壁多糖（即脂多糖和莢膜多糖）需要依靠噬菌體在裂解后期編碼的蛋白質(zhì)——穿孔素，參與膜的通透性，內(nèi)溶素穿過周質(zhì)并降解肽聚糖[10]，使噬菌體遺傳物質(zhì)進(jìn)入宿主菌。③增殖：進(jìn)入宿主菌內(nèi)的遺傳物質(zhì)利用細(xì)菌核苷酸、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生物合成[11]。對于遺傳物質(zhì)是DNA的噬菌體來說，DNA可直接轉(zhuǎn)錄成mRNA，從而誘導(dǎo)宿主菌核糖體合成蛋白質(zhì)[12]；對于遺傳物質(zhì)為RNA的噬菌體，RNA需逆轉(zhuǎn)錄為DNA，再進(jìn)行與DNA噬菌體相似的過程。④裝配：新合成的蛋白質(zhì)通過頭部的裝配、尾部的裝配、頭與尾部結(jié)合三個(gè)過程進(jìn)行組合，最后核酸與蛋白質(zhì)外殼組合為子代噬菌體。⑤釋放：在特殊噬菌體裂解酶的作用下，將細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行裂解，子代噬菌體從宿主菌中釋放出來并開始新的感染循環(huán)。噬菌體還可作為疫苗治療疾病。如圖1所示[9]，噬菌體疫苗分為噬菌體展示疫苗和噬菌體DNA疫苗[13]。噬菌體展示疫苗中，所需抗原的特定蛋白質(zhì)或肽被設(shè)計(jì)成在噬菌體表面表達(dá)，導(dǎo)致免疫原性反應(yīng)[14]；在噬菌體DNA疫苗中，噬菌體被用作載體，在強(qiáng)大的真核啟動子的控制下，將外源抗原DNA導(dǎo)入噬菌體基因組，抗原基因?qū)⒃诿庖呦到y(tǒng)的靶細(xì)胞中表達(dá)[14]，從而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

圖1 噬菌體和噬菌體蛋白間的相互作用及其在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上靶向結(jié)構(gòu)示意圖[9]

2 噬菌體對豬生長性能的影響

近年來，噬菌體在仔豬飼糧中的應(yīng)用研究成為熱點(diǎn)。Lee等[15]在教槽料中添加1 g/kg噬菌體提高仔豬斷奶頭數(shù)、斷奶重和日增重（ADG）。Lee等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，3.0×1010CFU產(chǎn)毒素大腸桿菌K88（ETEC K88）攻毒仔豬ADG顯著降低（361 vs.98 g/d），而給攻毒組仔豬連續(xù)飼喂1.0×107PFU/kg噬菌體飼糧（L86噬菌體，從商業(yè)豬場豬排泄物中分離）14 d可顯著提高仔豬ADG（186 vs.98 g/d）。Hosseindoust等[17]通過2×2因子設(shè)計(jì)研究了飼糧中添加噬菌體對污染豬舍或非污染豬舍中飼養(yǎng)仔豬生長性能的影響，研究者在試驗(yàn)開始前10 d將腹瀉的非試驗(yàn)豬引入豬舍建立污染豬舍試驗(yàn)條件（不清理豬舍排泄物，且試驗(yàn)開始前不進(jìn)行消毒），研究發(fā)現(xiàn)，污染豬舍仔豬日采食量（ADFI）和ADG均顯著降低，飼喂含1 g/kg噬菌體35 d可提高仔豬ADG和飼料轉(zhuǎn)化率（FCR），且仔豬FCR受噬菌體×豬舍環(huán)境交互作用影響，具體表現(xiàn)為：在非污染豬舍條件下，添加噬菌體對仔豬FCR無影響（0.71 vs.0.70），而在污染豬舍條件下，添加噬菌體提高仔豬FCR（0.71 vs.0.67）。江西農(nóng)業(yè)大學(xué)游金明教授課題組近期研究發(fā)現(xiàn)，與抗生素對照組相比，200 mg/kg噬菌體組仔豬生長性能無顯著差異，但400 mg/kg噬菌體組仔豬ADG、ADFI和FCR均顯著提高。而與400 mg/kg噬菌體組相比，600 mg/kg噬菌體組仔豬生長性能并沒有進(jìn)一步提高[18-19]。這表明，噬菌體具有替代仔豬飼糧中抗生素的巨大潛力。Hosse?indoust等[20]分別給斷奶仔豬飼喂含0.34%氧化鋅、0.20%有機(jī)酸和0.1%噬菌體，試驗(yàn)期35 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管各組間斷奶仔豬ADFI無顯著差異，但相比對照組，飼糧中添加0.1%噬菌體顯著提高斷奶仔豬試驗(yàn)第0～21 d ADG和FCR，且噬菌體組仔豬生長性能與氧化鋅組、有機(jī)酸組無顯著差異。這表明，在促生長方面，噬菌體可作為仔豬飼糧中氧化鋅和有機(jī)酸替代產(chǎn)品。Kim等[21]進(jìn)行了兩項(xiàng)有關(guān)噬菌體在仔豬飼糧中的試驗(yàn)研究，試驗(yàn)一發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1 g/kg或1.5 g/kg噬菌體均可顯著提高斷奶仔豬ADG（424或421 vs.404 g/d），而對仔豬ADFI和FCR均無顯著影響；試驗(yàn)二進(jìn)一步采用2×2因子設(shè)計(jì)研究了噬菌體與益生菌的組合效應(yīng)（因子2為噬菌體水平：0 g/kg和1 g/kg；因子1為益生菌水平：0 g/kg和3 g/kg），但其結(jié)果發(fā)現(xiàn)噬菌體與益生菌對斷奶仔豬生長性能并沒有互作效應(yīng)。Lee等[15]也采用2×2因子設(shè)計(jì)探討了飼糧中添加噬菌體和氧化鋅對斷奶仔豬生長性能的影響，因子1為氧化鋅水平（0和0.34%），因子2為噬菌體水平（0和0.1%），試驗(yàn)期為35 d，主效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，盡管噬菌體和氧化鋅對斷奶仔豬ADFI無顯著影響，噬菌體或氧化鋅均顯著提高仔豬ADG和FCR，但并沒有發(fā)現(xiàn)仔豬生長性能受噬菌體×氧化鋅互作效應(yīng)的影響?？偟膩碚f，噬菌體在改善仔豬生長性能方面表現(xiàn)出眾，尤其是在飼養(yǎng)環(huán)境較差的條件下，其可作為飼用抗生素、氧化鋅、有機(jī)酸的有效替代品，但噬菌體與益生菌和氧化鋅等并沒有表現(xiàn)出組合效應(yīng)。

3 噬菌體對仔豬養(yǎng)分消化率的影響

諸多研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加噬菌體可提高仔豬養(yǎng)分消化率。Kim等[21]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1.5 g/kg噬菌體顯著提高斷奶仔豬[初始體重（7.77±0.25）kg，初始日齡(24±3)d]試驗(yàn)第21 d粗蛋白質(zhì)全腸道表觀消化率和試驗(yàn)第35 d干物質(zhì)全腸道表觀消化率。Lee等[22]報(bào)道，飼糧中添加0.1%噬菌體顯著提高斷奶仔豬[初始體重（7.34±0.27）kg]試驗(yàn)第7、21 d和35 d干物質(zhì)全腸道表觀消化率，且提高試驗(yàn)第7 d和第21 d粗蛋白質(zhì)全腸道表觀消化率。Hosseindoust等[17]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1 g/kg噬菌體提高斷奶仔豬[初始體重（8.08±0.36）kg]試驗(yàn)第21 d粗蛋白質(zhì)全腸道表觀消化率。Hosseindoust等[20]研究也發(fā)現(xiàn)，相比對照組，飼糧中添加0.1%噬菌體顯著提高斷奶仔豬[初始體重（7.27±0.26）kg]試驗(yàn)第21 d粗蛋白質(zhì)全腸道表觀消化率和試驗(yàn)第35 d干物質(zhì)全腸道表觀消化率，且試驗(yàn)第35 d干物質(zhì)全腸道表觀消化率顯著高于0.34%氧化鋅組和0.20%有機(jī)酸組?？偟膩碚f，飼糧中添加噬菌體可提高仔豬干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)全腸道表觀消化率，且其添加效果可等同于（甚至高于）氧化鋅和有機(jī)酸的添加效果。

4 噬菌體對仔豬腸道形態(tài)的影響

噬菌體提高仔豬腸道養(yǎng)分消化率的重要原因是其可改善仔豬腸道形態(tài)。Zeng等[18]報(bào)道，與抗生素組相比，飼糧中添加400 mg/kg噬菌體顯著提高斷奶仔豬回腸和空腸絨毛高度、十二指腸、空腸和回腸絨毛高度/隱窩深度比值，而顯著降低空腸和回腸隱窩深度。Hosse?indoust等[20]研究也發(fā)現(xiàn)，相比對照組，飼糧中添加0.1%噬菌體顯著提高斷奶仔豬十二指腸和空腸絨毛高度，而其與0.34%氧化鋅和0.20%有機(jī)酸組仔豬腸道形態(tài)指標(biāo)無顯著差異。在Hosseindoust等[17]另一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1 g/kg噬菌體顯著提高斷奶仔豬空腸絨毛高度。Kim等[21]研究表明，與對照組相比，飼糧中添加1 g/kg或1.5 g/kg噬菌體均可顯著提高斷奶仔豬十二指腸和空腸絨毛高度，但1.5 g/kg噬菌體組仔豬腸道形態(tài)與1.0 g/kg噬菌體組間并無顯著差異。Lee等[22]通過2×2因子設(shè)計(jì)試驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加噬菌體或氧化鋅均可顯著提高斷奶仔豬十二指腸和空腸絨毛高度，但二者之間并無交互作用。Lee等[16]研究發(fā)現(xiàn)，給ETEC K88攻毒仔豬飼喂1×107PFU/kg噬菌體顯著提高回腸絨毛和隱窩中杯狀細(xì)胞密度，并提高回腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度比值，且降低回腸隱窩深度。總的來說，飼糧中添加噬菌體可改善仔豬小腸絨毛形態(tài)。

5 噬菌體對仔豬腸道微生物的調(diào)節(jié)作用

在實(shí)驗(yàn)室特定病原菌攻毒條件下，曾永娣等[19]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)毒素大腸桿菌攻毒導(dǎo)致斷奶仔豬空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸黏膜上大腸桿菌數(shù)及糞便中大腸桿菌數(shù)均顯著增加，但給仔豬飼喂含1.0×107PFU/kg噬菌體飼糧顯著降低攻毒仔豬腸道和糞便中大腸桿菌數(shù)。Cha等[23]研究發(fā)現(xiàn)，1×106PFU/g特異性裂解噬菌體CJ12組可顯著降低產(chǎn)毒素大腸桿菌ETEC攻毒仔豬糞便中ETEC數(shù)。Saez等[24]報(bào)道，連續(xù)5 d給仔豬（15 kg左右）飼喂微囊化噬菌體（5×1011PFU/d）可降低鼠傷寒沙門氏菌c4232攻毒仔豬腸道鼠傷寒沙門氏菌的定植。Byoung-Joo等[25]研究也發(fā)現(xiàn)，噬菌體可作為抗生素替代品來控制仔豬生產(chǎn)中沙門氏菌的感染。在仔豬生產(chǎn)試驗(yàn)上，Lee等[22]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.1%噬菌體或0.34%氧化鋅均可顯著提高斷奶仔豬試驗(yàn)第7、21 d和35 d糞便中總厭氧菌屬、雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬數(shù)，顯著降低糞便中大腸桿菌和盲腸梭菌屬數(shù)，但0.1%噬菌體和0.34%氧化鋅在調(diào)節(jié)仔豬糞便微生物組成方面并沒有互作效應(yīng)。Hosseindoust等[20]報(bào)道，相比對照組，飼糧中添加0.1%噬菌體顯著提高斷奶仔豬回腸中總厭氧菌屬、雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬數(shù)，而顯著降低回腸中大腸桿菌和盲腸梭菌屬數(shù)，且0.1%噬菌體組仔豬回腸和盲腸微生物組成與0.2%有機(jī)酸組間無顯著差異。而與0.34%氧化鋅組相比，0.1%噬菌體組仔豬回腸大腸桿菌屬和盲腸梭菌屬數(shù)均顯著降低。Zeng等[18]首次采用16S rDNA測序技術(shù)研究了無抗飼糧中添加噬菌體對斷奶仔豬腸道微生物組成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)仔豬盲腸微生物群以厚壁菌門和擬桿菌門為主，其次為變形菌門和軟質(zhì)菌門，噬菌體組比抗生素組多28個(gè)類群，400 mg/kg噬菌體增加擬桿菌屬6個(gè)類群、厚壁菌屬2個(gè)類群和變形菌門1個(gè)類群；與對照組相比，600 mg/kg噬菌體增加仔豬盲腸微生物中厚壁菌屬5個(gè)類群，擬桿菌屬5個(gè)類群，螺旋體5個(gè)類群和變形桿菌門1個(gè)類群?？偟膩碚f，噬菌體通過靶向或非靶向調(diào)節(jié)仔豬腸道菌群，尤其是靶向病原微生物，如大腸桿菌和沙門氏菌，從而在仔豬生產(chǎn)中緩解仔豬腹瀉和替代抗生素和氧化鋅等方面發(fā)揮巨大潛力。

6 小結(jié)與展望

綜上所述，噬菌體可有效緩解仔豬早期斷奶應(yīng)激，提高仔豬生長性能和養(yǎng)分消化率，并改善仔豬腸道形態(tài)和調(diào)節(jié)仔豬腸道菌群，在治療仔豬主要病原菌引起的疾病方面有著重要作用，具有替代抗生素、氧化鋅和有機(jī)酸的巨大潛力。

盡管噬菌體在仔豬生產(chǎn)中有很多優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一些問題不能忽略。首先，噬菌體對低pH較為敏感。其次，溫度也會影響噬菌體的作用效果。Smith等[26]報(bào)道，一些溫度敏感噬菌體的毒力在豬等多數(shù)動物體內(nèi)（37℃左右）有所下降。噬菌體的微膠囊化是現(xiàn)階段解決上述問題的有效手段。另外，噬菌體抗性的增加也是非常重要的一個(gè)問題，阻斷噬菌體受體、減少噬菌體核酸進(jìn)入宿主菌、切割噬菌體遺傳物質(zhì)等[27]，都可降低噬菌體感染效率。這也提示在實(shí)際生產(chǎn)過程中要控制添加劑量。此外，噬菌體與有機(jī)酸、氧化鋅、益生菌組合使用，也可有效改善仔豬生長性能。綜上所述，建議使用單一噬菌體時(shí)，添加劑量要保持在中等水平，并對噬菌體進(jìn)行微囊化等保護(hù)措施；與其他物質(zhì)組合使用時(shí)，選擇正向相互作用最大的物質(zhì)進(jìn)行配合。后續(xù)研究可重點(diǎn)關(guān)注：①噬菌體對不同生長階段豬的合理添加劑量；②噬菌體與其他添加劑的聯(lián)合使用及其作用機(jī)制等，為合理利用噬菌體提供理論依據(jù)，為仔豬生產(chǎn)的發(fā)展提供新思路。