表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑AG1478 對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物活性及纖溶酶原激活物抑制物1 的作用機(jī)制研究△

丁伯勇，王瑋，昝瑛

商洛市中心醫(yī)院1腫瘤科，2婦科，陜西 商洛 726000 3西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，西安 721000

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤，根據(jù)中國惡性腫瘤數(shù)據(jù)分析，中國有超過5 萬患者患有卵巢癌，病死率超過50%。卵巢位置隱蔽，多數(shù)患者確診時(shí)往往失去最佳治療時(shí)機(jī)，化學(xué)治療成為改善卵巢癌患者預(yù)后的主要治療方法。卵巢癌細(xì)胞生長速度快，向鄰近器官及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較快，化療能夠通過增加腫瘤細(xì)胞DNA 鏈損傷而抑制DNA 復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，減少卵巢癌細(xì)胞活性及生長。但是隨著臨床的應(yīng)用，部分患者出現(xiàn)藥物不耐受或化療耐藥，導(dǎo)致臨床療效較差，因此，如何抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，加快凋亡仍是眾多研究者探討的難題。卵巢癌的產(chǎn)生是由多因素、多因子共同作用的結(jié)果，纖溶酶原激活物抑制物1（plasminogen activator inhibitor type 1，PAI-1）主要位于人體第7 號(hào)染色體上，是絲氨酸蛋白酶抑制物的成員之一，主要在內(nèi)皮細(xì)胞中被合成，具有抑制纖溶酶原激活物，增加惡性腫瘤細(xì)胞活性的作用。卵巢癌細(xì)胞中PAI-1 表達(dá)升高，臨床發(fā)現(xiàn)PAI-1 可以特異性結(jié)合某信號(hào)后發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞侵襲作用。目前，隨著卵巢癌分子機(jī)制的研究，多種致癌基因及抑癌基因在腫瘤中的作用機(jī)制逐漸被闡明，靶向治療將成為攻克卵巢癌的主要方法。在卵巢癌分子機(jī)制深入研究中，酪氨酸激酶受體家族及其轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的功能失常導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為異常，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是酪氨酸激酶受體家族成員之一，存在酪氨酸激酶活性，能夠結(jié)合表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）發(fā)揮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而影響細(xì)胞生物學(xué)行為。卵巢癌組織中EGFR 表達(dá)是正常組織的多倍以上，因此，EGFR 抑制劑能夠成為治療卵巢癌的潛在靶點(diǎn)。AG1478 是EGFR 高效選擇性酪氨酸激酶抑制劑，已經(jīng)證實(shí)具有抗肺癌、肝癌細(xì)胞生長及促進(jìn)凋亡作用。但是關(guān)于AG1478對(duì)卵巢癌的體外干預(yù)研究比較少見，所以，本研究以此作為創(chuàng)新點(diǎn)分析AG1478 對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為及PAI-1 的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑與儀器

CaOV-3 細(xì)胞購自上海名勁生物科技有限公司；AG1478 購自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司。胎牛血清購自上海冰晴生物科技有限公司；PAI-1 抗體購自上海信裕生物科技有限公司；尿激酶型纖溶酶原激活劑受體（urokinase type plasminogen activator receptor，uPAR）抗體購自北京博邁斯科技發(fā)展有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl terazolium，MTT）試劑盒、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均購自金克?。ū本┥锛夹g(shù)有限公司；Trizol 購自北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司。蛋白電泳儀購自萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒和儀器均購自上?？道噬锟萍加邢薰?。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將低溫冷藏的CaOV-3 細(xì)胞快速移入37 ℃水中溶解，3000 r/min 離心10 min（離心半徑15 cm），離棄上清液，加入培養(yǎng)基，5%CO、37.5 ℃培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，1～2 天更換新的無血清培養(yǎng)液，細(xì)胞生長到90%時(shí)，加入蛋白液消化，傳代保存，以備后用。

1.3 藥物配置及分組

AG1478 溶解在DMSO 溶液中，配置成5、10、15、20 μmol 濃度的儲(chǔ)蓄液，保存環(huán)境為-20 ℃；CaOV-3 細(xì)胞分為空白組和干預(yù)組，空白組為無藥物干預(yù)的CaOV-3 細(xì)胞，干預(yù)組分別為干預(yù)A 組（5 μmol 的AG1478 溶液）、干預(yù)B 組（10 μmol 的AG1478 溶液）、干預(yù)C 組（15 μmol 的AG1478 溶液）和干預(yù)D 組（20 μmol 的AG1478 溶液），采用不同濃度的AG1478 干預(yù)。

1.4 MTT 法檢測(cè)CaOV-3 細(xì)胞抑制率

采用傳代方法將各組CaOV-3 細(xì)胞按5×10/ml接種到96 孔板中，于含有1%胎牛血清的培養(yǎng)基中同步消化。吸去原培養(yǎng)液，每個(gè)濃度6 個(gè)復(fù)孔，均加入5 mg/ml 的MTT 溶液20 μl，培養(yǎng)24、48、72 h后，吸棄培養(yǎng)液，再在每個(gè)孔中加入50 μl DMSO，搖勻后放入490 nm 波長下檢測(cè)光密度（optical density，OD）值，取3 次平均值，細(xì)胞抑制率（%）=100%-（實(shí)驗(yàn)組OD 值-空白組OD 值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD 值）×100%。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CaOV-3 細(xì)胞凋亡率

將0.25%蛋白酶消化的CaOV-3細(xì)胞以5×10/ml接種到胎牛血清培養(yǎng)基中過夜，24 h 后，收集每組細(xì)胞，選擇3 個(gè)樣本，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌1 次，100 μl 接種于5 ml 流式試管中，將5 μl 的膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）與5 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）混合后染色，無光條件下，孵育15 min 后注入400 μl 結(jié)合緩沖液混勻，予以洗滌3 次，后采用流式細(xì)胞儀分析CaOV-3細(xì)胞凋亡率。

1.6 Transwell 小室檢測(cè)CaOV-3 細(xì)胞侵襲能力

各組CaOV-3 細(xì)胞數(shù)目為5×10/ml，將50 mg/L的基質(zhì)膠稀釋后加入小室上層，上室中加入細(xì)胞懸液，下室中加入少量胎牛血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，拭去殘留細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，計(jì)算CaOV-3 侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.7 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測(cè)PAI-1 和uPAR 蛋白表達(dá)

各組CaOV-3 細(xì)胞接種、數(shù)量同上，加入少量胰蛋白酶消化后，運(yùn)轉(zhuǎn)離心機(jī)后保留上清液，放入樣孔中，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜用TBS 緩沖液浸泡10 min，反復(fù)PBS 沖洗，每次5 min，加入一抗PAI-1、uPAR和GAPDH 抗體（1∶500），二抗加入羊抗小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（1∶2000），雜交沖洗。后將膜浸入電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）工作液，隨后進(jìn)行檢測(cè)，獲取圖像。

1.8 RT-PCR 法檢測(cè)PAI-1、uPAR mRNA

檢測(cè)CaOV-3 細(xì)胞株中

PAI

-

1

、

uPAR

基因，嚴(yán)格按照PCR 儀器說明書進(jìn)行操作。各組5×10/ml 的CaOV-3 細(xì)胞用0.125%胰蛋白酶消化，1000 r/min離心20 min（離心半徑15 cm），采用Trizol 法提取總RNA，無核酸酶溶解。將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，獲得反轉(zhuǎn)錄體系，條件：42 ℃作用60 min，72 ℃作用5 min，4 ℃終點(diǎn)。每個(gè)細(xì)胞設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，以

GAPDH

為內(nèi)參，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)作用3 min，95 ℃作用5 s，58 ℃退火，共40個(gè)循環(huán)（表1）。

表1 引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 AG1478 對(duì)CaOV-3 細(xì)胞抑制率的影響

不同時(shí)間點(diǎn)各組CaOV-3 細(xì)胞抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。不同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)B組、干預(yù)C組和干預(yù)D組CaOV-3細(xì)胞抑制率均高于干預(yù)A組，干預(yù)D組CaOV-3細(xì)胞抑制率均高于干預(yù)B 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）；其余干預(yù)組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。（表2）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組CaOV-3細(xì)胞抑制率的比較（%，±s）

2.2 AG1478 對(duì)CaOV-3 細(xì)胞凋亡率的影響

各組CaOV-3 細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。干預(yù)組CaOV-3 細(xì)胞凋亡率均高于空白組，干預(yù)B 組、干預(yù)C 組、干預(yù)D 組CaOV-3細(xì)胞凋亡率均高于干預(yù)A 組，干預(yù)D 組CaOV-3細(xì)胞凋亡率高于干預(yù)B 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（表3、圖1）

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組CaOV-3細(xì)胞的凋亡率

表3 各組CaOV-3 細(xì)胞凋亡率的比較（%，±s）

2.3 AG1478 對(duì)CaOV-3 細(xì)胞侵襲數(shù)目的影響

各組CaOV-3 細(xì)胞侵襲數(shù)目比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。干預(yù)組CaOV-3 細(xì)胞侵襲數(shù)目均少于空白組，干預(yù)B 組、干預(yù)C 組及干預(yù)D 組CaOV-3 細(xì)胞侵襲數(shù)目均少于干預(yù)A 組，干預(yù)D 組CaOV-3 細(xì)胞侵襲數(shù)目少于干預(yù)B 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（圖2、表4）

表4 各組CaOV-3 細(xì)胞侵襲數(shù)目的比較（±s）

圖2 Transwell小室檢測(cè)各組CaOV-3細(xì)胞侵襲能力（結(jié)晶紫染色，×200）

2.4 Western blot法檢測(cè)PAI-1、uPAR蛋白表達(dá)情況

各組CaOV-3 細(xì)胞中PAI-1 和uPAR 蛋白表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。干預(yù)組CaOV-3 細(xì)胞中PAI-1 和uPAR 蛋白表達(dá)量均低于空白組，干預(yù)B 組、干預(yù)C 組及干預(yù)D 組CaOV-3 細(xì)胞中PAI-1 和uPAR 蛋白表達(dá)量均低于干預(yù)A 組，干預(yù)D 組CaOV-3 細(xì)胞中PAI-1 和uPAR 蛋白表達(dá)量均低于干預(yù)B 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（表5、圖3）

圖3 Western blot法檢測(cè)各組CaOV-3細(xì)胞中PAI-1和uPAR蛋白表達(dá)情況

表5 各組CaOV-3 細(xì)胞中PAI-1 和uPAR 蛋白表達(dá)量的比較（±s）

2.5 RT-PCR 法檢測(cè)PAI-1、uPAR mRNA 表達(dá)情況

各組CaOV-3 細(xì)胞中

PAI

-

1

、

uPAR

mRNA 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。干預(yù)組CaOV-3細(xì)胞中

PAI

-

1

、

uPAR

mRNA 均低于空白組，干預(yù)B組、干預(yù)C 組及干預(yù)D 組CaOV-3 細(xì)胞中

PAI

-

1

、

uPAR

mRNA 均低于干預(yù)A 組，干預(yù)D 組CaOV-3 細(xì)胞中

PAI

-

1

、

uPAR

mRNA 均低于干預(yù)B 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（表6）

表6 各組CaOV-3 細(xì)胞中PAI-1、uPAR mRNA 表達(dá)水平的比較（±s）

3 討論

目前，降低卵巢癌細(xì)胞生長、侵襲的干預(yù)機(jī)制在于減少腫瘤細(xì)胞核中DNA 復(fù)制及合成，或抑制DNA 有絲分裂，對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生毒性損傷，但是缺點(diǎn)在于不能排除對(duì)非腫瘤細(xì)胞的破壞，損害機(jī)體免疫功能。腫瘤分子生物學(xué)的研究開創(chuàng)了治療卵巢癌等多種惡性腫瘤的新紀(jì)元，靶向治療方法在治療腫瘤疾病中具有重要意義。卵巢癌患者中發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶受體家族的異常表達(dá)，因此，以酪氨酸激酶受體作為靶點(diǎn)的治療，通過使腫瘤細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生改變使其活性受到抑制。AG1478 是EGFR 靶向抑制劑，在以往文獻(xiàn)中證實(shí)能夠抑制宮頸癌、乳腺癌、胃癌及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長。

卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為異常是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素，因此了解其影響生物學(xué)行為的關(guān)鍵因子至關(guān)重要。EGFR 可以在細(xì)胞表面被檢測(cè)，是一種跨膜糖蛋白，是細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，當(dāng)EGFR異常時(shí)細(xì)胞增殖不受控制，發(fā)生持續(xù)性增殖，導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化。卵巢癌細(xì)胞EGFR 過度激活可引起下游一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)一步誘發(fā)卵巢癌細(xì)胞快速生長、分化導(dǎo)致細(xì)胞永生化。張寶月和張俊農(nóng)研究表示，卵巢癌細(xì)胞中存在EGFR 表達(dá)，結(jié)合相應(yīng)配體后會(huì)啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞生長周期，酪氨酸蛋白激酶（tyrosine protein kinase，TPK）信號(hào)可激活腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，將生長信號(hào)傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，刺激卵巢癌細(xì)胞生長及侵襲。卵巢癌細(xì)胞中針對(duì)EGFR 的靶向治療的主要方法包含阻斷EGFR 結(jié)合配體，減少自身磷酸化，降低二聚體形成而阻斷信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)傳遞，其次是使用EGFR抑制劑，通過減少EGFR 激酶上腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）結(jié)合點(diǎn)結(jié)合，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，減少卵巢癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成。AG1478 作為新型EGFR 抑制劑，能夠通過干擾腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，競(jìng)爭(zhēng)性與ATP 結(jié)合區(qū)結(jié)合，減少EGFR 表達(dá)，減少轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)傳入從而引起一系列細(xì)胞生物學(xué)行為改變而發(fā)揮抑癌作用。以往文獻(xiàn)證實(shí)，體外胃癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的AG1478干預(yù)后胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為侵襲及遷移能力降低，凋亡加劇，與依賴性抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號(hào)通路上調(diào)叉頭框蛋白O3a（forkhead box O3a，F(xiàn)OXO3a）信號(hào)通路發(fā)揮作用相關(guān)。劉粉霞等證實(shí)，AG1478 通過調(diào)節(jié)促凋亡基因增加細(xì)胞凋亡信號(hào)因子表達(dá)而增加胃癌細(xì)胞凋亡，降低侵襲及轉(zhuǎn)移能力。本研究中，與空白組相比，干預(yù)組CaOV-3細(xì)胞生長、侵襲能力減弱，凋亡提高，且具有時(shí)間劑量依賴性，說明AG1478 對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長及侵襲具有抑制作用，機(jī)制可能與EGFR 信號(hào)活性抑制后伴隨PI3K/AKT 信號(hào)及Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transduction and activator of transcription，STAT）、磷脂酶Cγ（phospholipase C-γ，PLC-γ）下游因子信號(hào)失活，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻礙，導(dǎo)致細(xì)胞增殖減慢，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路表達(dá)活躍而加快卵巢癌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

PAI-1 是纖溶過程調(diào)節(jié)因子，表達(dá)增加能夠?qū)е卵ㄐ约膊〖皭盒阅[瘤疾病。卵巢癌細(xì)胞中PAI-1 陽性表達(dá)升高，外源性轉(zhuǎn)染后能夠提高卵巢癌細(xì)胞活性，增加轉(zhuǎn)移能力，且臨床診斷中PAI-1與患者病理分期升高及發(fā)生轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，說明PAI-1 是檢測(cè)卵巢癌患者腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后的重要指標(biāo)。uPAR 在卵巢癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進(jìn)作用，能夠通過激活金屬蛋白酶降解卵巢癌細(xì)胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞活性。賀珊等證實(shí)，與癌旁組織相比，uPAR 在卵巢癌組織中表達(dá)水平升高，與腫瘤復(fù)發(fā)、分期及預(yù)后相關(guān)。PAI-1 和uPAR 在卵巢癌細(xì)胞中能夠特異性結(jié)合形成復(fù)合物，隨后發(fā)生降解出現(xiàn)細(xì)胞表面分布不均，能夠增加卵巢癌細(xì)胞增殖及浸潤能力。張孔雁等證實(shí)PAI-1 能夠與uPAR 上游因子uPA 結(jié)合，減少uPA 過度消化，起到促進(jìn)作用。PAI-1 能夠減少卵巢癌組織降解，且參與血管生成作用。EGFR 信號(hào)與PAI-1 之間存在關(guān)聯(lián)，在國外研究中指出

EGFR

siRNA 阻斷PAI-1以及Raf-1 表達(dá)，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號(hào)通路通過PAI-1 的表達(dá)調(diào)節(jié)發(fā)揮抗疾病作用。Alberti 等證實(shí)，在血管破裂疾病中AG1478 抑制EGFR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或引入激酶缺陷的EGFR 構(gòu)建體可有效阻斷PAI-1 和結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）的表達(dá)，說明AG1478 具有抑制PAI-1 作用。本研究中，干預(yù)組細(xì)胞中PAI-1 和uPAR 蛋白及基因表達(dá)均降低，可能與AG1478抑制ERK 信號(hào)通路細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為，調(diào)節(jié)凋亡信號(hào)通路相關(guān)，機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本研究具有一定不足，實(shí)驗(yàn)方法存在單一性，研究機(jī)制需要進(jìn)一步完善，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能產(chǎn)生偏差，后期本課題組會(huì)增加樣本量，細(xì)化實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，為卵巢癌臨床研究提供實(shí)踐依據(jù)。

綜上所述，EGFR 抑制劑AG1478 能夠有效降低卵巢癌CaOV-3細(xì)胞存活率及侵襲性，加快凋亡，這與阻礙PAI-1 和uPAR 信號(hào)通路表達(dá)相關(guān)。