兩種生長(zhǎng)階段的牛蛙蝌蚪對(duì)鹽度的耐受性研究

梁家豪 鮮雪梅

摘要 在人工養(yǎng)殖條件下，鹽度常作為影響蝌蚪生長(zhǎng)發(fā)育的環(huán)境因子之一。在實(shí)驗(yàn)室溫度（23.1±2.0） ℃環(huán)境下，采用單因子靜態(tài)急性毒性試驗(yàn)法研究2種生長(zhǎng)期牛蛙 （Rana catesbeiana ?Shaw）蝌蚪對(duì)水體鹽度的耐受能力。結(jié)果表明，在試驗(yàn)條件水質(zhì)下，處于25期牛蛙蝌蚪及五趾分化期牛蛙蝌蚪的24、48、72和96 h半致死濃度分別為6.41、5.44、5.50、5.37 g/L及12.56、10.48、7.67、4.09 g/L，安全值分別為1.18 和2.19 g/L。在相同條件下，五趾分化期牛蛙蝌蚪比25期牛蛙蝌蚪對(duì)鹽度的耐受能力更強(qiáng)。建議在人工養(yǎng)殖過(guò)程中，將25期牛蛙蝌蚪及五趾分化期牛蛙蝌蚪分池飼養(yǎng)，二者長(zhǎng)期生存的安全鹽度控制在1.3 g/L以下。

關(guān)鍵詞 牛蛙蝌蚪;半致死濃度;鹽度;耐受性;安全值

中圖分類號(hào) S 917.4 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）14-0085-04

Abstract Under the conditions of artificial culture，salinity was often used as one of the environmental factors that affected the growth and development of tadpoles.The tolerance to salinity of tadpoles of ?Rana catesbeiana ?Shaw at two growth stages was studied by using a singlefactor static acute toxicity test under the laboratory environment with an average temperature of （23.1±2.0）℃.The results showed that under the experimental conditions，24，48，72 and 96 h LC50 of ?R.catesbeiana ?tadpoles at the 25 stage and 5toed differentiation stage were 6.41，5.44，5.50，5.37 and 12.56，10.48，7.67，4.09 g/L respectively，SC value was 1.18 and 2.19 g/L respectively.Under the same conditions，the tolerance to salinity of ?R.catesbeiana ?tadpole at 5toed differentiation stage was stronger than that of bullfrog tadpole at the 25 stage.It was suggested that in the process of artificial breeding， R.catesbeiana ?tadpoles at 25stage and 5toed differentiation stage should be fed in separate ponds，and the safe salinity of their longterm survival should be controlled below 1.3 g/L.

Key words ?Rana catesbeiana ?tadpoles;Half lethal concentration;Salinity;Tolerance;SC

基金項(xiàng)目 阿壩師范學(xué)院青年基金項(xiàng)目（ASC20-04）;國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（202010646031）;2019年學(xué)生科研項(xiàng)目（201910089，201910099）;阿壩師范學(xué)院質(zhì)量工程項(xiàng)目（201909023）。

作者簡(jiǎn)介 梁家豪 （1996—），男，四川西昌人，研究方向：動(dòng)物生理生態(tài)。*通信作者，講師，從事動(dòng)物生理生態(tài)研究。

收稿日期 2020-12-23

牛蛙 （Rana catesbeiana ?Shaw）屬于兩棲綱（Amphibia）無(wú)尾目（Anura）蛙科（Ranidae）[1]，體型較大。牛蛙肉味道非常鮮美，且肉質(zhì)細(xì)膩嫩滑，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)元素，具有較高的藥用價(jià)值。牛蛙肉不僅可以食用，而且可以藥用調(diào)理，蛙皮也能供人使用，可以說(shuō)是名副其實(shí)的“寶藏蛙”。牛蛙肉可作為上等美味食材和高級(jí)的養(yǎng)生藥膳，是一種蛋白質(zhì)含量高、脂肪和膽固醇含量低的健康肉類。牛蛙肉的藥用價(jià)值也非常高，具有滋補(bǔ)解毒的功效[2]。對(duì)于做完手術(shù)后需要營(yíng)養(yǎng)恢復(fù)的傷者來(lái)說(shuō)，牛蛙肉可以促進(jìn)傷口的愈合。此外，牛蛙皮也作為樂(lè)器原材料和皮革制作原料[3]，其品質(zhì)優(yōu)良，還可以提煉高級(jí)別黏膠[4];牛蛙體內(nèi)脂肪可煉制蛙油[5]，剩余一些牛蛙的下腳料可經(jīng)過(guò)加工制成肉類飼料。

人工養(yǎng)殖的牛蛙生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)量高、價(jià)值高、成本低，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益[6]。20世紀(jì)50年代末期我國(guó)首次引入該物種[7]。迄今為止，牛蛙養(yǎng)殖在我國(guó)經(jīng)過(guò)多年的迅速發(fā)展，已成為我國(guó)特種水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要品種之一。目前國(guó)內(nèi)研究大多集中在牛蛙的人工養(yǎng)殖和育種等方面[8-17]。在人工養(yǎng)殖蛙類過(guò)程中，影響個(gè)體生長(zhǎng)的主要因素有水質(zhì)、溫度[18- 21]、營(yíng)養(yǎng)水平[22]、光照、養(yǎng)殖密度[8-17]等。對(duì)蝌蚪而言，水質(zhì)的影響因素尤為重要，包括pH、鹽度、堿度等[23-29]。

在兩棲類動(dòng)物的人工養(yǎng)殖過(guò)程中，可以通過(guò)離子誘導(dǎo)技術(shù)來(lái)提高雌蛙比例[30]，該方法使用的主要鹽類為氯化鈉，而氯化鈉也是人工養(yǎng)殖水產(chǎn)過(guò)程中常用于消毒和預(yù)防疾病的藥物。國(guó)內(nèi)有關(guān)水生生物鹽度適應(yīng)性的研究大多集中在魚(yú)類、蝦類[31-32] ，不同魚(yú)類的鹽度耐受能力有明顯差異[33-34] ，如鯽魚(yú)幼魚(yú)對(duì)鹽度的耐受能力高于大鱗鲃?dòng)佐~(yú)、松浦鏡鯉幼魚(yú)、草魚(yú)幼魚(yú)和鰱魚(yú)幼魚(yú)[35]。目前蛙類蝌蚪對(duì)鹽度耐受性的相關(guān)研究主要集中在沼澤綠牛蛙 （Rana grylio） 蝌蚪、棘胸蛙蝌蚪、中華大蟾蜍蝌蚪和中國(guó)林蛙蝌蚪。研究表明，沼澤綠牛蛙蝌蚪屬于狹鹽性和低耐鹽動(dòng)物，其試驗(yàn)安全值為1.9 g/L[23]，而中國(guó)林蛙蝌蚪是一種狹鹽性、低耐鹽的漠鹽種生物，其安全值應(yīng)控制在2.0 g/L以下[24-27]。李三相等[28]也認(rèn)為中國(guó)林蛙蝌蚪長(zhǎng)期生存的鹽度上限為2.0 g/L。中國(guó)林蛙變態(tài)蝌蚪雖具有一定的鹽度適應(yīng)能力，但安全值較低，因此在生產(chǎn)上用氯化鈉消毒時(shí)，其濃度應(yīng)控制在10.0 g/L以下，而用于提高雌蛙比例時(shí)鹽度控制在2.0 g/L以下[29]。在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，常存在因化學(xué)藥劑使用不規(guī)范、用量控制不到位而導(dǎo)致蝌蚪的大量死亡，從而造成大量的經(jīng)濟(jì)損失。牛蛙作為主要養(yǎng)殖蛙類之一，其蝌蚪的鹽度耐受性相關(guān)資料仍相對(duì)較少。筆者通過(guò)設(shè)置不同梯度鹽度條件，觀察并記錄牛蛙蝌蚪生存在相應(yīng)水體中的存活情況和急性中毒行為表現(xiàn)，探究牛蛙蝌蚪生存的安全鹽度值以及適應(yīng)鹽度上限，旨在為人工養(yǎng)殖牛蛙過(guò)程中氯化鈉的使用量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以處于五趾分化期[36]大牛蛙蝌蚪[體長(zhǎng)（10.74±2.74）cm，體重（10.60±4.80）g]和處于25期[36]小牛蛙蝌蚪[體長(zhǎng)（0.93±0.14）cm，體重（1.12±0.02）×10-2g]為研究對(duì)象，大、小牛蛙蝌蚪的鹽度耐受性試驗(yàn)使用的容器分別為20 L塑料圓桶和6 L方形塑料盆。試驗(yàn)前均在室內(nèi)馴養(yǎng)2 d，試驗(yàn)用水為曝氣2 d的自來(lái)水，鹽度為0.097 g/L（經(jīng)濟(jì)型便攜式鹽度計(jì)），pH保持與野外自然生活水體相當(dāng)，控制在6.8～7.0，數(shù)值有偏差的試驗(yàn)組用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至安全值[37-38];試驗(yàn)期間平均水溫保持在23.1 ℃，空氣濕度保持在80%左右，試驗(yàn)期間不喂食、不換水。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用單因子急性毒性試驗(yàn)法。以水體中氯化鈉濃度作為鹽度耐受試驗(yàn)指標(biāo)，試驗(yàn)所用氯化鈉為市場(chǎng)在售食用鹽。該試驗(yàn)分為預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)設(shè)置的鹽度梯度按等比例遞增，設(shè)立7個(gè)試驗(yàn)組（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 g/L）和空白對(duì)照組（以曝氣自來(lái)水作為試驗(yàn)用水），每組設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定正式試驗(yàn)的鹽度范圍，設(shè)置8個(gè)試驗(yàn)組（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 g/L）和空白對(duì)照組（以曝氣自來(lái)水作為試驗(yàn)用水），每組設(shè)立3個(gè)平行試驗(yàn)。每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)放入15尾蝌蚪。觀察并記錄24、48、72和96 h蝌蚪的行為表現(xiàn)及死亡數(shù)量，并及時(shí)清理死亡蝌蚪，對(duì)蝌蚪死亡的判別標(biāo)準(zhǔn)如下：蝌蚪沉落或漂浮在水面，腹部朝上，輕觸蝌蚪體無(wú)反應(yīng)即視為死亡。

1.3 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用WPS 2019軟件整理，使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)不同時(shí)間的死亡率，以死亡率和濃度建立半對(duì)數(shù)坐標(biāo)，采用直線內(nèi)插法計(jì)算出半致死濃度（LC50），按以下公式計(jì)算安全值（SC）[39]：

SC=48 h LC50 ×0.3/（24 h LC50/48 h LC50）2（1）

式中，24 h LC50、48 h LC50為24 h和48 h的半致死濃度;SC為安全值。

2 結(jié)果與分析

2.1 各鹽度下牛蛙蝌蚪的中毒行為表現(xiàn)

2.1.1 小牛蛙蝌蚪。

試驗(yàn)24 h 后4.0、5.0、6.0 g/L試驗(yàn)組小蝌蚪均停棲在水底、正常游泳，7.0 g/L試驗(yàn)組小蝌蚪活力下降，游動(dòng)緩慢。隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，5.0、6.0、7.0 g/L試驗(yàn)組逐漸出現(xiàn)游動(dòng)急促，接著活力下降、游動(dòng)緩慢，甚至有個(gè)別出現(xiàn)側(cè)倒現(xiàn)象（表1），側(cè)倒個(gè)體數(shù)與第二天死亡個(gè)體數(shù)幾乎相等。死亡蝌蚪體型較活蝌蚪明顯縮小，體泛灰色，軀體僵直，尾根部彎曲（圖1a、b）;在SOPTOP光學(xué)顯微鏡下，以PL10*/22（目鏡）×4*/0.10（與10*/0.25的物鏡）倍數(shù)觀察，尾部邊緣破損，軀體少部分皮膚破損，隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，破損程度增大（圖1c、d）。

2.1.2 大牛蛙蝌蚪。

大牛蛙蝌蚪在試驗(yàn)過(guò)程中的行為表現(xiàn)如表2所示。由表2可知，試驗(yàn)24 h后2.0、3.0、4.0、5.0 g/L試驗(yàn)組大牛蛙蝌蚪表現(xiàn)相似，停棲水底，偶爾浮出水面換氣，游泳能力正常;6.0、7.0、8.0 g/L試驗(yàn)組大牛蛙蝌蚪在試驗(yàn)開(kāi)始1 h左右出現(xiàn)間歇性躍出水面的現(xiàn)象，24 h后出現(xiàn)1～2尾側(cè)倒，人為刺激后能正常游動(dòng)。48 h后2.0、3.0、4.0 g/L試驗(yàn)組和空白對(duì)照組的大牛蛙蝌蚪行為無(wú)明顯差別，停棲水底，偶有游動(dòng)。

試驗(yàn)開(kāi)始48 h，5.0 g/L及以上鹽度試驗(yàn)組出現(xiàn)側(cè)翻現(xiàn)象，人為刺激后反應(yīng)速度明顯變慢且游動(dòng)速度也有所下降，鹽度越高現(xiàn)象越明顯。72和96 h后各組大牛蛙蝌蚪的行為較之前變化不大，隨著鹽度的升高，大牛蛙蝌蚪的反應(yīng)速度明顯下降。死亡的蝌蚪皮膚出現(xiàn)不同程度皺縮，集中出現(xiàn)在腹中部至后肢根部（圖1e），隨著鹽度的升高和試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，皺縮程度加重。72 h 6.0 g/L及以上試驗(yàn)組個(gè)別試驗(yàn)個(gè)體的尾尖處有輕微破損，出現(xiàn)小弧形缺口（圖1f）。死亡個(gè)體中個(gè)別有啃食現(xiàn)象，腹部皮膚不完整，中部泛白，邊緣泛紅（圖1g）。

2.2 死亡率、致死濃度及安全值

2.2.1 小牛蛙蝌蚪。由表3可知，在試驗(yàn)鹽度范圍內(nèi)，隨著鹽度的升高，各試驗(yàn)組小牛蛙蝌蚪的死亡率逐漸增加。鹽度為8.0 g/L試驗(yàn)組小牛蛙蝌蚪24 h死亡率為100%，鹽度為7.0 g/L試驗(yàn)組小牛蛙蝌蚪48 h死亡率超過(guò)93%，鹽度為6.0 g/L試驗(yàn)組小牛蛙蝌蚪96 h死亡率為100%，對(duì)照組的死亡率為0。從表3可以看出，試驗(yàn)96 h內(nèi)鹽度4.0 g/L試驗(yàn)組小牛蛙蝌蚪的死亡率幾乎無(wú)變化。

采用直線內(nèi)插法計(jì)算各試驗(yàn)鹽度對(duì)小牛蛙蝌蚪的零致死濃度、半致死濃度、全致死濃度和安全值（表3）。由表3可知，24 h LC50為6.41 g/L，48 h LC50為5.44 g/L，72 h LC50為5.50 g/L，96 h LC50為5.37 g/L，安全值（SC）為1.18 g/L。

2.2.2 大牛蛙蝌蚪。由表4可知，在試驗(yàn)鹽度范圍內(nèi)，隨著鹽度的升高，各試驗(yàn)組大牛蛙蝌蚪的死亡率總體上呈增加趨勢(shì)。從表4可以看出，鹽度為2.0、3.0和5.0 g/L試驗(yàn)組24 h死亡率均為0，其余組死亡率不超過(guò)13.3%。4.0、7.0和8.0 g/L試驗(yàn)組48 h死亡率最高（26.7%），2.0和5.0 g/L試驗(yàn)組48 h死亡率最低（6.7%）。5.0和8.0 g/L試驗(yàn)組72 h死亡率均為53.3%。其余試驗(yàn)組72 h死亡率均未超過(guò)20%。2.0 g/L試驗(yàn)組96 h死亡率最低（33.3%），其余試驗(yàn)組死亡率均大于等于53.3%，其中8.0 g/L試驗(yàn)組96 h死亡率最高，為80%。對(duì)照組大牛蛙蝌蚪的死亡率為0。

采用直線內(nèi)插法計(jì)算各試驗(yàn)鹽度對(duì)大牛蛙蝌蚪的零致死濃度、半致死濃度、全致死濃度和安全值（表4）。由表4可知，24 h LC50為12.56 g/L，48 h LC50為10.48 g/L，72 h LC50為7.67 g/L，96 h LC50為4.09 g/L，安全值為2.19 g/L。

3 討論

不同動(dòng)物的滲透壓調(diào)節(jié)方式不同[40]，對(duì)鹽度的耐受性存在明顯差異。研究發(fā)現(xiàn)，中華小長(zhǎng)臂蝦[31]的鹽度96 h LC50為34.31 g/L，黑斑口蝦蛄對(duì)鹽度的適應(yīng)性較強(qiáng)，其適宜鹽度范圍為18～30 g/L[32]，麥穗魚(yú)的鹽度 96 h LC50為11.246 g/L[33]，昆明裂腹魚(yú)幼魚(yú)96 h LC50為11.819 g/L[34]，大磷肥、草魚(yú)、鏡鯉、鯽和鰱的96 h LC50分別為（11.744±1.749）、（9.913±1.354）、（10.686±1.075）、（12.663±0.408）和（9.380±0.589） g/L[35]，淡水魚(yú)類的鹽度耐受性比較接近。牛蛙蝌蚪對(duì)鹽度的耐受能力相對(duì)較弱，該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小牛蛙蝌蚪和大牛蛙蝌蚪的鹽度96 h LC50分別為5.37和4.09 g/L。兩棲綱不同蛙類蝌蚪對(duì)鹽度的耐受性差異不明顯。沼澤綠牛蛙的安全值為1.9 g/L[23];楊富億等[24-27]報(bào)道吉林省內(nèi)中國(guó)林蛙蝌蚪的安全值應(yīng)控制在2.0 g/L以下，甘肅省內(nèi)中國(guó)林蛙蝌蚪的安全值為1.93 g/L[28]。該研究結(jié)果顯示，大牛蛙蝌蚪的鹽度安全值為2.19 g/L，與中國(guó)林蛙、沼澤綠牛蛙蝌蚪的研究結(jié)果相近，牛蛙蝌蚪可能也具有狹鹽性。25期的小牛蛙蝌蚪的鹽度安全值僅為1.18 g/L，可能是因?yàn)槠潺g期相對(duì)較小，自身滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)發(fā)育不完善，其對(duì)鹽度的耐受能力較弱，導(dǎo)致其安全值偏低[41]。因此，當(dāng)漁業(yè)水體鹽度為1.5 g/L時(shí)，適宜牛蛙蝌蚪的生存。建議在人工養(yǎng)殖過(guò)程中，將25期牛蛙蝌蚪及五趾分化期牛蛙蝌蚪分池飼養(yǎng)，二者長(zhǎng)期生存的安全鹽度控制在1.3 g/L以下。該試驗(yàn)對(duì)不同生長(zhǎng)階段牛蛙蝌蚪的鹽度耐受性進(jìn)行了比較研究，探究了不同生長(zhǎng)階段的牛蛙蝌蚪的半致死濃度以及安全值，為人工養(yǎng)殖牛蛙過(guò)程中氯化鈉的用量提供了理論依據(jù)。

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