環(huán)境DNA技術(shù)在軟體動物資源中的應(yīng)用

陳金萍 李雄輝 周春花 歐陽珊 吳小平

摘要 環(huán)境DNA（environmental DNA，eDNA）是指有機體與外界進行物質(zhì)交換（攝食、排泄等）時脫落的DNA片段。eDNA技術(shù)是指從環(huán)境樣品（土壤、沉積物、水體等）中直接提取DNA片段后，利用測序技術(shù)對生物進行定性或定量分析。與傳統(tǒng)方法相比，eDNA技術(shù)具有效率高、分辨率高、采樣無損傷性等優(yōu)點。環(huán)境DNA技術(shù)自問世以來，受到了廣泛的應(yīng)用，主要應(yīng)用于水生生物的生物監(jiān)測、保護生物學(xué)（單（多）種檢測、豐度估計）、入侵生物學(xué)（早期物種檢測、被動監(jiān)視）和環(huán)境監(jiān)測等。綜述了環(huán)境DNA技術(shù)在軟體動物研究中的取樣方法、研究進展、優(yōu)勢、局限，以及該方法在軟體動物入侵物種防治、瀕危物種保護、物種多樣性評價和生物量檢測中的研究現(xiàn)狀，同時對環(huán)境DNA在軟體動物資源中的應(yīng)用前景進行了展望，以期為軟體動物資源多樣性的研究和保護提供新的技術(shù)和手段。

關(guān)鍵詞 環(huán)境DNA;軟體動物;取樣方法;應(yīng)用;研究現(xiàn)狀

中圖分類號 Q 958.1 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2021）14-0022-03

Abstract Environmental DNA （eDNA） refers to DNA fragments that organisms shed in their surrounding environment when in exchange for material （ingestion， excretion， etc.） with otuside，eDNA technology refers to the direct extraction of DNA fragments from environmental samples （soil， sediment and water， etc.）， and the use of sequencing technology for qualitative or quantitative analysis of organisms. Compared with traditional methods， eDNA technology is more high efficiency， high resolution and no damage in sampling. eDNA technology has been widely used since it came into being. Mainly used for biomonitoring， conservation biology （single and multispecies detection， abundance estimates）， invasion biology （early species detection， passive surveillance） and environmental assessment. This article reviewed the sampling method， research progress， advantages and limitations of eDNA technology in the research of mollusks，and the research status of this method in the prevention and control of mollusks invasion， the protection of endangered species， the evaluation of biodiversity and biomass. At the same time， the application prospect of eDNA in mollusks resources was prospected， it can provide new technique and methods for the research and protection of mollusks biodiversity.

Key words Environmental DNA;Mollusks;Sampling method;Application;Research status

基金項目 國家重點研發(fā)計劃“藍色糧倉”重點專項（2018YFD0900801）。

作者簡介 陳金萍（1995—），女，江西上饒人，碩士研究生，研究方向：環(huán)境DNA水生生物。

*通信作者：周春花，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事種群遺傳研究;吳小平，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事生物多樣性研究。

收稿日期 2020-10-23

軟體動物分布于淡水、海水、陸地上，在生態(tài)系統(tǒng)中扮演著極其重要的作用，如維持生態(tài)平衡、凈化水環(huán)境等。但是由于近年來城市工業(yè)的迅速發(fā)展，水域受到人為污染，而軟體動物一般遷移性較差，一旦遭到水質(zhì)污染，較難回避。再加上外來物種入侵、氣候變化等加劇了軟體動物所面臨的威脅[1]。而之前的傳統(tǒng)調(diào)查方法有一定的局限性，對環(huán)境有較大的破壞性[2]，所以急需一種行之有效的方法——環(huán)境DNA（environmental DNA，eDNA）技術(shù)來檢測和管理軟體動物資源。eDNA技術(shù)的最大優(yōu)勢就是非侵入性取樣，對目標物種及周圍環(huán)境不造成傷害?，F(xiàn)在，禁漁政策已開展，所以該技術(shù)對于研究水體中生物尤為重要。

eDNA是指從環(huán)境（如土壤、水體沉積物、糞便等）樣品中提取的DNA，因為動物會與外界進行物質(zhì)交換，所以自身的皮毛、細胞組織、黏液等會在環(huán)境中保存一段或者很久時間，這樣就能提取DNA成功進行遺傳檢測[3]。eDNA技術(shù)是指從環(huán)境樣品（土壤[4]、沉積物[5]、水體[6-8]等）中直接提取DNA片段后，利用測序技術(shù)對生物進行定性或定量分析的方法[9]。近年來，eDNA技術(shù)已應(yīng)用于不同生態(tài)系統(tǒng)的物種多樣性研究、資源生物量檢測、瀕危種和入侵種的檢測;在國外，各種生物的檢測也用到該技術(shù)，如兩棲類[10-11]、魚類[12-14]、腹足類[15]等。筆者主要對eDNA技術(shù)在軟體動物資源研究中的方法、優(yōu)勢以及局限、展望等進行了綜述，以期為該類生物多樣性的研究和保護提供新的技術(shù)和方法。

1 eDNA技術(shù)在軟體動物研究中的取樣方法

1.1 ?eDNA水樣的采集及處理

eDNA技術(shù)中采樣是極為重要的一步。水樣主要來源于實驗室水箱、池塘、溪流、湖泊和海洋等。水樣采集方法可分為沉淀法和過濾法。沉淀法適用于少量水樣采集，采樣量通常為15 mL[10，16];過濾法適用于流水或靜水的大型無脊椎動物，需要大量水樣[3]，在軟體類的研究中，每個樣點的采水量一般為1～2 L [12，17-18]。濾膜的種類有很多，研究表明，不同的濾膜具有不同的 DNA 回收率，其中使用混合纖維濾膜或硝酸纖維素濾膜的DNA回收效果最佳[19]。濾膜有很多種孔徑，對于清澈的溪流和海水，0.45 μm孔徑最合適[16]。

1.2 樣品DNA提取

eDNA提取主要有CTAB提取法、試劑盒提取法等。CTAB提取法是將水樣加至33 mL的無水乙醇和1.5 mL的3 mol/L醋酸鈉，再加入一定量的CTAB緩沖液、蛋白酶K緩沖液、一定比例的苯酚∶氯仿∶異戊醇，其中經(jīng)過離心等步驟。試劑盒提取法是指先用真空泵抽濾有DNA的濾膜，再用試劑盒提取，純化DNA，把雜質(zhì)去除。提取軟體動物環(huán)境DNA的試劑盒的種類有很多，提取雙殼類的DNA一般采用Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kits，提取蝸牛的DNA采用Omega Bio-tek E.Z.N.Mollusc DNA試劑盒[20]。

1.3 eDNA分析

分析包括引物設(shè)計、PCR、高通量測序。①針對不同的目標物種選取DNA基因片段（軟體動物環(huán)境DNA研究通常用的是線粒體DNA片段，通常有16S rRNA[20-21]、18S rRNA[5]、COI[22-23]）來設(shè)計引物，用Primer 5、QPrimer、Primer-BLAST等軟件來設(shè)計，一般來說，ecoPrimer軟件更常用，因為它可以基本滿足環(huán)境DNA引物的要求[24]。②PCR擴增，在eDNA分析方法中，PCR的類型非常多，如普通PCR[25-26]、定量PCR[22、27-28]、巢式PCR、數(shù)字PCR[6]等，最常用的是普通PCR、定量PCR（qPCR）[29]。③高通量測序及數(shù)據(jù)處理，先進行去噪，即除去低質(zhì)量的序列，這些序列包括嵌合體/長度過短/重復(fù)的序列;聚類分析，即根據(jù)序列相似度進行歸類，獲得可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），每個OTUs應(yīng)該只包含一個物種的序列;物種分類學(xué)注釋，把這些OTUs在數(shù)據(jù)庫中進行比對;數(shù)據(jù)分析，如α-多樣性分析、物種豐度分析、差異顯著性統(tǒng)計檢驗分析等。

2 環(huán)境DNA技術(shù)在軟體動物資源研究中的應(yīng)用

2.1 軟體動物瀕危種和入侵種的檢測

eDNA技術(shù)應(yīng)用較廣，特別是對于瀕危軟體動物，因為瀕危物種密度很低，傳統(tǒng)方法（蚌耙、采泥器等）難以監(jiān)測到，eDNA技術(shù)避免了這些問題。針對瀕危物種檢測，需要設(shè)計一些特異性引物，既要保證瀕危物種能被檢測到，又要保證其他的尤其是親緣關(guān)系較近的物種不會被檢測到。研究者大多都是利用COI基因片段來擴增[30]。目前，通過eDNA分析檢測方法已經(jīng)實現(xiàn)了對淡水珍珠蚌種群[22]、珠母珍珠蚌（ Margaritifera margaritifera ?L.）[31]、淡水蚌（ Lampsilis fasciola、Ligumia nasuta、Ptychobranchus fasciolaris、Quadrula quadrula ）[32]等物種的檢測，證實了環(huán)境 DNA 監(jiān)測方法在瀕危物種和稀有物種的監(jiān)測中頗具潛力。

目前外來物種的入侵情況日趨嚴重，當外來物種入侵時，它們對原本的生態(tài)平衡破壞較大，使生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)不完善，從而對本地物種的種類和數(shù)量產(chǎn)生影響[10]。但是在入侵早期階段，外來物種的數(shù)量不多，很難發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)現(xiàn)時，就已經(jīng)造成了危害，而eDNA技術(shù)使入侵物種的早期檢測成為可能，如Egan等[33]、Ardura等[34]在太平洋里海地區(qū)監(jiān)測到了斑馬貽貝（ Dreissena polymorpha ），并遏制它進一步傳播;Clusa等[35]、Goldberg等[15]監(jiān)測了新西蘭泥螺（ Potamopyrgus antipodarum ）早期入侵;同樣，Blackman等[36]設(shè)計特異性的引物來檢測 Dreissena rostriformis bugensis 和D.polymorpha 這2種入侵蚌在現(xiàn)場試驗中的降解速率，從而可以初步判斷它們?nèi)肭謺r間;除此之外，在入侵早期就有效遏制的還有金貽貝（ Limnoperna fortunei ）[37]。

除了能在早期檢測到入侵物種之外，eDNA分析技術(shù)還能判斷它們的入侵程度，Pearrubia等[38]對伊比利亞半島水域的扁貽貝（ Dreissena rostriformis ）進行了定量分析，判斷了該蚌的入侵程度;Ardura等[39]在波羅的海發(fā)現(xiàn)北美楔蛤（ Rangia cuneata ）已經(jīng)蔓延到了整個歐洲;Clusa等[40]檢測河蜆（ Corbicula fluminea ）、背角無齒蚌（ Sinanodonta woodiana ）等貝類在伊比利亞河流的分布情況，發(fā)現(xiàn)其種群在擴張;Klymus等[20]檢測雙殼綱和腹足綱某些類群的入侵程度，結(jié)果表明eDNA方法可以顯著加強入侵物種的識別能力。eDNA技術(shù)還可以檢測到物種是如何入侵的，如歐洲泥螺（ Peringia ulvae ）[41]，通過壓艙水入侵新環(huán)境。近年來利用eDNA對瀕危物種進行檢測的研究越來越多[42]，而對于入侵物種的研究一直是熱門問題，eDNA對瀕危物種和入侵物種檢測的有效性已經(jīng)得到一定的證明，它能突破傳統(tǒng)方法的局限性[15]，并且檢測的效果與傳統(tǒng)方法一致或略高于傳統(tǒng)方法[2，43-44]。

2.2 軟體動物物種多樣性檢測

物種多樣性的檢測方法有很多，這些方法通常是為特定的生物群體設(shè)計的，隨著eDNA技術(shù)愈加成熟，將它應(yīng)用于軟體動物物種多樣性研究成為一種新潮流。軟體動物是淡水生態(tài)系統(tǒng)的一個重要組成部分，它們對環(huán)境變化很敏感，當生境條件下降時，軟體動物往往是第一個被清除的動物，因此它們可以作為生態(tài)系統(tǒng)的物種多樣性的檢測指標。Deiner等[45]研究采樣和提取方法如何影響淡水生物多樣性，以蚌類 （Unio tumidus 等4種生物）為目標，檢測這些物種eDNA的檢出率來判斷哪種采樣和提取方法最好，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過濾和PCI（（酚-氯仿-異戊醇）提取法效果最好;Prié等[21]分別對蚌目和簾蛤目設(shè)計了eDNA通用引物16S rRNA來檢測雙殼類的生物多樣性，并且與傳統(tǒng)方法進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)eDNA分析的物種檢出率更高?？傊h(huán)境DNA分析技術(shù)為生物多樣性研究提供新的工具[46]。

2.3 軟體動物生物量檢測

eDNA對物種進行定量分析主要是檢測物種存在與否，進而來判斷其生物量[18]，然而估計物種生物量較復(fù)雜，雖然有部分研究表明，水體中環(huán)境DNA 的濃度與目標物種的生物量呈正相關(guān)[11，13]，如Carlsson等[27]研究發(fā)現(xiàn)在愛爾蘭的某條河，珍珠蚌（ Margaritifera margaritifera ）數(shù)量最多的地方eDNA濃度也最高，并且預(yù)測了該屬種群數(shù)量;Miralles等[26]在伊比利亞北部的某河研究發(fā)現(xiàn)侏儒貽貝（ Xenostrobus securis ）數(shù)量與eDNA的PCR產(chǎn)物量呈正相關(guān)?？傊?，eDNA的濃度受到很多條件（溫度、紫外線、微生物群落、DNA降解速率等[7，16]）的影響，所以eDNA濃度與生物量之間的關(guān)系很復(fù)雜，既然這兩者關(guān)系不好推測，那么有的研究者通過建立蚌類eDNA的下游傳輸模型來量化eDNA濃度與目標物種密度之間的聯(lián)系[28，47]?？傊?，研究者一直致力于研究一套eDNA濃度與生物量關(guān)系的模型，魚類[12-13]就有成功的例子，并且準確度較高。但是軟體動物的生物量監(jiān)測有一定的困難，因此eDNA技術(shù)進行軟體動物生物量的檢測還需探索。

3 eDNA分析技術(shù)在軟體動物研究中的優(yōu)勢與局限

eDNA分析技術(shù)在軟體動物研究中的優(yōu)勢如下：①省時、省力，監(jiān)測效率高;②不會對生態(tài)系統(tǒng)或目標物種造成任何干擾，減少了外來物種和病原體的入侵風險;③允許在事先不知道哪些物種存在于水體中的情況下進行檢測;④突破環(huán)境限制、有效性限制;⑤引物有通用性，可以用于全球生物多樣性評估[43];⑥試驗操作較簡單，不依賴于分類專家的專業(yè)知識來鑒定物種。

盡管如此，eDNA技術(shù)仍存在一些局限，如eDNA不能區(qū)分活的和死的生物;不能區(qū)分本地的DNA和異地的DNA;不能獲得目標生物體的大小、發(fā)育階段和性別的信息;不容易準確估計調(diào)查物種的數(shù)量、密度和生物量信息;不能區(qū)分雜種和母系物種[43]。

4 展望

eDNA已成為闡明生態(tài)學(xué)和進化過程中的有力工具[48]。近年來eDNA技術(shù)發(fā)展很快，但在軟體動物中的研究起步稍晚。eDNA技術(shù)不僅能用于監(jiān)測瀕危種和入侵種、評估生物量，還可以檢測種群遺傳[49]、評估水生生態(tài)系統(tǒng)的生境[50]等。我國的生物多樣性豐富度在全球首屈一指，但是用eDNA技術(shù)對軟體動物的多樣性研究非常有限，究其原因一是軟體動物的數(shù)據(jù)庫不是很全面，二是研究者對軟體動物的重要性認識不夠，三是適合軟體動物環(huán)境DNA研究的引物尚不成熟。所以我國要加強軟體動物的研究。國外eDNA技術(shù)研究軟體動物主要是研究入侵種和瀕危種，對于軟體動物生物多樣性和資源量監(jiān)測報道極其有限。那么今后需要加強物種多樣性和資源量的檢測，因為這對保護軟體動物種質(zhì)資源、生態(tài)環(huán)境的修復(fù)具有重要意義。當然，要用eDNA方法來評估物種多樣性，首要就是設(shè)計針對動物類群的通用水環(huán)境DNA引物，因為目前通用引物大多是擴增動物組織提取的DNA，所以是否能用來檢測水環(huán)境DNA還需要探索。

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