頭頸部惡性腫瘤類(lèi)器官研究現(xiàn)狀及應(yīng)用

奉佳連，文忠

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州 510282)

類(lèi)器官是體外三維培養(yǎng)構(gòu)建出的多細(xì)胞團(tuán)塊，具有自我更新和自我組織能力, 并且維持了其來(lái)源組織的生理結(jié)構(gòu)和功能的特點(diǎn)[1-3]。近來(lái)眾學(xué)者將類(lèi)器官技術(shù)應(yīng)用于惡性腫瘤的治療，已建立多種組織的類(lèi)器官如頭頸部腫瘤[4-6]、內(nèi)耳[7]、甲狀腺[8]、視網(wǎng)膜[9]、腦[10]、新型冠狀病毒感染模型[11]等。類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)在腫瘤研究上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):①維持腫瘤細(xì)胞的高度異質(zhì)性;②維持腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境基質(zhì)的接觸極性, 更好地模擬體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境;③來(lái)源于臨床組織的類(lèi)器官培養(yǎng)效率高、耗時(shí)少;④腫瘤類(lèi)器官同時(shí)擁有腫瘤細(xì)胞系和小鼠PDX模型的優(yōu)點(diǎn)，可進(jìn)行遺傳操作且具備三維復(fù)雜系統(tǒng)特性。結(jié)合類(lèi)器官技術(shù)，直接針對(duì)患者腫瘤組織進(jìn)行個(gè)體化研究和藥物篩選，建立臨床前模型，用于頭頸惡性腫瘤的精準(zhǔn)治療?，F(xiàn)就頭頸惡性腫瘤個(gè)體化類(lèi)器官在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代背景下的研究現(xiàn)狀及其潛在的臨床應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

1 頭頸部惡性腫瘤與精準(zhǔn)醫(yī)療

頭頸惡性腫瘤被列為全球第六大常見(jiàn)的癌癥，占全身惡性腫瘤的21.2%，占男性惡性腫瘤的47%，占女性惡性腫瘤的2.5%，鱗狀細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的組織學(xué)類(lèi)型(97%)[12]。吸煙和飲酒是頭頸惡性腫瘤發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素[13]，而EB病毒和人乳頭瘤病毒分別與鼻咽癌和口咽癌有關(guān)[14-15]。頭頸部惡性腫瘤的治療方案選擇根據(jù)腫瘤所在的解剖位置、腫瘤分期、患者年齡、健康狀況及合并疾病而有所不同。開(kāi)放和微創(chuàng)手術(shù)在內(nèi)的手術(shù)被認(rèn)為是大多數(shù)口咽癌和早期喉癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，而其他頭頸部癌癥則采用放射治療或同步放化療。據(jù)統(tǒng)計(jì)，即便采取積極治療，頭頸惡性腫瘤的復(fù)發(fā)率也達(dá)40%～50%。

2015年美國(guó)啟動(dòng)了“全美計(jì)劃”，這是一項(xiàng)由政府資助的精準(zhǔn)醫(yī)療計(jì)劃，招募超過(guò)100萬(wàn)人參與該計(jì)劃。精準(zhǔn)醫(yī)療的核心在于能夠指導(dǎo)醫(yī)療保健決策為患者提供最有效的治療，從而提高治療質(zhì)量，同時(shí)減少對(duì)不必要的診斷和療法探索[16]。腫瘤精準(zhǔn)治療的實(shí)現(xiàn)極大程度上依賴(lài)于藥物敏感性的檢測(cè)，但目前尚缺乏有效檢測(cè)腫瘤藥物敏感性的可靠方法，傳統(tǒng)的藥物篩選系統(tǒng)篩選出的藥物臨床應(yīng)用價(jià)值低[17]。頭頸惡性腫瘤個(gè)體化藥物敏感性篩查的復(fù)雜性及艱巨性，反映了對(duì)于抗癌藥物耐藥、化療藥物篩選系統(tǒng)、靶向藥物篩選系統(tǒng)認(rèn)識(shí)不足的客觀現(xiàn)實(shí)，亟需更全面、多角度的研究來(lái)進(jìn)行揭示。類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)，給頭頸惡性腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)療進(jìn)一步發(fā)展帶來(lái)希望。

2 頭頸腫瘤類(lèi)器官模型

2.1 頭頸腫瘤類(lèi)器官的研究簡(jiǎn)史

為了更好地研究癌癥，研究人員已建立各種疾病模型，包括癌細(xì)胞系、動(dòng)物模型以及新興的類(lèi)器官模型，這些疾病模型各有其優(yōu)缺點(diǎn)(表1)。癌細(xì)胞系可快速建立，用于藥物開(kāi)發(fā)和高通量篩選，由于其缺乏對(duì)腫瘤結(jié)構(gòu)和微環(huán)境的解釋?zhuān)拗破渥鳛榕R床前模型的應(yīng)用潛力。腫瘤異種移植可以維持特定的腫瘤異質(zhì)性以及腫瘤細(xì)胞與其周?chē)|(zhì)細(xì)胞之間的相互作用，已經(jīng)被用于臨床前藥物評(píng)估、生物標(biāo)記物鑒定及放療敏感性[18]。異種移植也存在缺點(diǎn)，需要大的小鼠群體，耗費(fèi)大量資金和人力，阻礙了它們?cè)诰珳?zhǔn)醫(yī)學(xué)中的實(shí)際應(yīng)用[19]。

表1 疾病模型優(yōu)劣勢(shì)對(duì)比分析表

頭頸腫瘤三維培養(yǎng)已有較長(zhǎng)時(shí)間，早在1989年，Sacks 等[20]從單層細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)展到具有三維細(xì)胞組織的體外模型多細(xì)胞腫瘤球體。K?pf-Maier 等[21]在1991年利用類(lèi)器官技術(shù)培養(yǎng)了患者組織來(lái)源的下咽表皮樣癌類(lèi)器官以及口咽鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官。Saito 等[22]建立功能性甲狀腺類(lèi)器官，能合成甲狀腺球蛋白、碘攝取以及甲狀腺激素的產(chǎn)生和釋放。Driehuis等[23]首次詳細(xì)描述了來(lái)自健康黏膜上皮細(xì)胞以及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞類(lèi)器官的培養(yǎng)條件，建立頭頸腫瘤類(lèi)器官活組織生物庫(kù)?？焖儆行У亟⒒罱M織生物庫(kù)，有望在更廣泛的人群中有針對(duì)性地研究個(gè)體化藥物。已有研究證明腫瘤類(lèi)器官概括了相應(yīng)來(lái)源的器官特異性基因表達(dá)特征、特定的組織空間結(jié)構(gòu)和原始組織的功能，能夠在體外保留患者組織本身對(duì)新型藥劑的敏感性，可用于發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證新型藥物，以及模擬和研究靶向藥物的抗性[24-25]。類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)使得我們能夠建立新型頭頸惡性腫瘤模型來(lái)研究和篩選藥物以用于精準(zhǔn)治療。

2.2 頭頸腫瘤類(lèi)器官培養(yǎng)

類(lèi)器官由兩種主要類(lèi)型的干細(xì)胞培養(yǎng)而成：①多能胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；②成體干細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞。目前有多種類(lèi)器官培養(yǎng)方法,大部分需要干細(xì)胞、基質(zhì)膠和富含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基。小鼠類(lèi)器官維持培養(yǎng)需要加入N-乙酰-1-半胱氨酸、煙酰胺、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)10、R-spondin蛋白，人頭頸腫瘤類(lèi)器官維持培養(yǎng)需要加入的細(xì)胞因子與小鼠類(lèi)器官相似，但需額外加入B27細(xì)胞培養(yǎng)添加劑、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βI型受體抑制劑、前列腺素E2、FGF2、骨形態(tài)遺傳蛋白。使用腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)頭頸腫瘤類(lèi)器官，平均而言，可以在10～14 d內(nèi)建立，石蠟包埋腫瘤類(lèi)器官的免疫組化結(jié)果顯示基底細(xì)胞標(biāo)記物腫瘤蛋白P63(tumor protein 63，TP63)和細(xì)胞增殖相關(guān)抗原(marker of proliferation，MKI67或Ki-67)，提示腫瘤類(lèi)器官培養(yǎng)成功。在腫瘤類(lèi)器官外層可見(jiàn)增殖性標(biāo)記MKI67+/TP63+基底細(xì)胞；在類(lèi)器官內(nèi)層細(xì)胞中可見(jiàn)分化標(biāo)記角蛋白13(keratin 13，KRT13)；另外使用透射電子顯微鏡觀察到角質(zhì)形成細(xì)胞的特征，例如大量的張力絲和橋粒；以上提示腫瘤類(lèi)器官能夠概括起源組織的特性[27]。以往研究人員將腫瘤組織分解成單個(gè)細(xì)胞后在含有基質(zhì)膠的培養(yǎng)基中制備類(lèi)器官，容易出現(xiàn)失巢凋亡，為了提高類(lèi)器官培養(yǎng)率，可加入Ras同源基因-Rho相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶抑制劑抑制失巢凋亡[28]。最近，Tanaka 團(tuán)隊(duì)[5]提出癌組織起源球方法，即將手術(shù)切除或活檢獲得的腫瘤組織簡(jiǎn)單分解成腫瘤組織碎片而不是單個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞簇在24 h內(nèi)迅速形成球形，進(jìn)而快速有效建立頭頸腫瘤類(lèi)器官模型，能夠有效避免失巢凋亡的發(fā)生。王顯文等[29]使用鼻咽癌患者來(lái)源腫瘤組織，通過(guò)腫瘤形態(tài)學(xué)、組織病理學(xué)鑒定(KI67、CD133免疫組化)、EB病毒編碼RNA原位雜交技術(shù)等鑒定方法，成功培養(yǎng)鼻咽癌腫瘤類(lèi)器官，并用于藥物篩選，然而，筆者在文中亦提到研究的局限性。腫瘤微環(huán)境復(fù)雜，包含血管、神經(jīng)、免疫細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞等，在體外重建腫瘤微環(huán)境是類(lèi)器官技術(shù)的難點(diǎn)，為了體外重建腫瘤免疫微環(huán)境，Neal 等[30]將腫瘤組織培養(yǎng)成腫瘤類(lèi)器官后，使用氣液界面方法將類(lèi)器官與具有天然免疫細(xì)胞(T、B、NK、巨噬細(xì)胞)的腫瘤上皮細(xì)胞在同基因免疫活性宿主中共培養(yǎng)；Nakamura等[31]提出類(lèi)器官與腫瘤成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)方案；此外，血管類(lèi)器官的成功培養(yǎng)，有望解決體外腫瘤類(lèi)器官血管化難題[32-33]。

3 頭頸部腫瘤類(lèi)器官的應(yīng)用

3.1篩選基因突變

Tanaka等[5]進(jìn)行全基因組測(cè)序和磷酸化定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以鑒定和探索對(duì)頭頸惡性腫瘤患者有用的生物標(biāo)記物。Driehuis等[23]成功培養(yǎng)了31例頭頸惡性腫瘤類(lèi)器官，對(duì)其他的16例進(jìn)行基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)69%存在P53突變，43%存在磷脂酰肌醇- 4,5-雙磷酸3-激酶催化亞基α突變，25%存在KRAS原癌基因突變，在58個(gè)差異最大的表達(dá)基因中(P<0.01)，發(fā)現(xiàn)激肽釋放酶相關(guān)肽酶6、溶質(zhì)載體有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員1B3、同源盒C13基因、鈣結(jié)合蛋白1、ETS同源因子和丁酰膽堿酯酶發(fā)生了突變。研究人員對(duì)腫瘤類(lèi)器官和腫瘤組織進(jìn)行對(duì)比測(cè)試，發(fā)現(xiàn)腫瘤類(lèi)器官出現(xiàn)變異等位基因頻率富集，這可能是由于腫瘤類(lèi)器官缺乏免疫、血管、神經(jīng)等腫瘤微環(huán)境所致。此外，還對(duì)比檢測(cè)了腫瘤類(lèi)器官以及正常組織類(lèi)器官，僅發(fā)現(xiàn)腫瘤類(lèi)器官存在單核苷酸變異、染色體的缺失和插入。

3.2 測(cè)試抗癌藥物敏感性及耐藥性

腫瘤類(lèi)器官模型已用于藥物篩選研究和生物標(biāo)志物分析[2, 34-35]。Shah等[6]將細(xì)胞代謝的光學(xué)成像技術(shù)與類(lèi)器官技術(shù)結(jié)合，對(duì)類(lèi)器官細(xì)胞異質(zhì)性和標(biāo)準(zhǔn)化治療的反應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡和體內(nèi)腫瘤體積以及在平行研究中驗(yàn)證每個(gè)治療組的治療功效進(jìn)行了定量和定性分析。結(jié)果表明光學(xué)代謝成像在治療1 d后對(duì)類(lèi)器官中的治療反應(yīng)敏感(P<0.05)，具有不同代謝表型的細(xì)胞亞群可提供靈敏的高通量測(cè)定，以簡(jiǎn)化頭頸惡性腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的過(guò)程。Tanaka[5]團(tuán)隊(duì)分別測(cè)試相應(yīng)類(lèi)器官對(duì)順鉑及多西他賽的藥物敏感性以及耐藥范圍，類(lèi)器官藥物敏感性及耐藥性存在個(gè)體差異。Driehuis等[23]使用了突變和轉(zhuǎn)錄作用、染色體穩(wěn)定性、異種移植、新藥和常規(guī)化療/放療測(cè)試。此外，Driehuis 團(tuán)隊(duì)還使用頭頸鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官模型通過(guò)抗體-納米體光敏劑結(jié)合物來(lái)評(píng)估表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)靶向光動(dòng)力療法的潛力，發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同患者的腫瘤類(lèi)器官的EGFR表達(dá)水平不同，EGFR表達(dá)水平與EGFR靶向光動(dòng)力療法的療效相關(guān)，從周?chē)＝M織培養(yǎng)的類(lèi)器官顯示出比其腫瘤對(duì)應(yīng)類(lèi)器官更低的EGFR表達(dá)水平，提示納米體靶向光動(dòng)力療法比抗體靶向光動(dòng)力療法更有效[4]。體外建立頭頸惡性腫瘤類(lèi)器官模型，保留了原代腫瘤的許多特性，這些類(lèi)器官可以預(yù)測(cè)體內(nèi)的藥物敏感性，且有望成為頭頸惡性腫瘤精確治療的有用工具。

3.3 頭頸惡性腫瘤免疫治療

細(xì)胞程序性死亡受體/配體(programmed cell death protein 1/programmed cell death 1 ligand 1，PD-1/PD-L1)免疫療法是當(dāng)前備受矚目的新一類(lèi)抗癌療法, 抗PD-1抗體和PD-L1抗體在頭部腫瘤尤其是在頭頸鱗狀細(xì)胞癌的治療上已經(jīng)取得了重要的進(jìn)展[36-37]。目前至少有5種抗PD-1和抗PD-L1抗體正處于臨床研究階段：pembrolizumab和nivolumab作用于PD-1靶點(diǎn)，德瓦魯單抗(durvalumab，又稱(chēng)MEDI4736)、阿維單抗(avelumab)和阿特珠單抗(atezolizumab，又稱(chēng)MPDL3280A)作用于PD-L1靶點(diǎn)，但頭頸惡性腫瘤的免疫療法相對(duì)滯后，類(lèi)器官技術(shù)的應(yīng)用有助于免疫治療的發(fā)展。Neal等[30]利用腫瘤類(lèi)器官成功地模擬了具有抗PD-1和/或抗PD-L1擴(kuò)增和激活腫瘤抗原特異性浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞并引發(fā)腫瘤細(xì)胞毒性的免疫檢查點(diǎn)封鎖，該研究提示具有內(nèi)源性免疫基質(zhì)的腫瘤類(lèi)器官能進(jìn)行免疫腫瘤學(xué)研究，并促進(jìn)個(gè)性化免疫療法檢測(cè)，有利于癌癥患者的個(gè)體化精準(zhǔn)治療。

3.4 再生醫(yī)學(xué)

頭頸部惡性腫瘤的放射治療會(huì)導(dǎo)致唾液腺的損傷，出現(xiàn)口腔干燥等癥狀。Bücheler 等[38]在微載體中培養(yǎng)唾液腺類(lèi)器官，提出了重構(gòu)唾液腺功能的新概念。Ozdemir 等[39]利用從正常唾液腺組織分離的原代人涎腺肌上皮細(xì)胞(human salivary gland myoepithelial cells，hSMECs)和干/祖細(xì)胞來(lái)生成唾液腺微組織，在多代培養(yǎng)過(guò)程中，肌上皮細(xì)胞的表型與其他外分泌組織的表型一致。此外，hSMECs分泌基底膜蛋白，表達(dá)腎上腺素能和膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)受體，并在副交感神經(jīng)激動(dòng)劑的作用下釋放細(xì)胞內(nèi)鈣。功能性腮腺類(lèi)器官成功培養(yǎng)，有望重構(gòu)唾液腺功能，幫助癌癥患者解決口干問(wèn)題。

4 展望

為了建立更好的藥物篩選模型，研究人員應(yīng)用并發(fā)展了頭頸部腫瘤類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)，利用類(lèi)器官擁有的能夠長(zhǎng)期傳代、維持遺傳異質(zhì)性、可凍存及復(fù)蘇等優(yōu)點(diǎn),有望建立頭頸腫瘤類(lèi)器官生物庫(kù)。頭頸腫瘤類(lèi)器官生物庫(kù)一旦建立, 我們可以使用各種類(lèi)型的頭頸部類(lèi)器官腫瘤模型,對(duì)其進(jìn)行基因組測(cè)和表達(dá)譜分析，可以用于篩選突變基因，作為藥物篩選“替身”，測(cè)試抗癌藥物的敏感性以及耐藥性，開(kāi)發(fā)免疫治療新藥等。放射治療所致唾液腺損傷有望使用腮腺類(lèi)器官重構(gòu)唾液腺功能，幫助癌癥患者解決口干問(wèn)題。類(lèi)器官模型有許多優(yōu)點(diǎn)，但也存在缺點(diǎn)。類(lèi)器官培養(yǎng)的難點(diǎn)在于如何在體外重建腫瘤微環(huán)境，現(xiàn)有研究人員將腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，作為評(píng)價(jià)腫瘤微環(huán)境的有用工具[31]，也有使用干/祖細(xì)胞、支架和特定的調(diào)節(jié)因子來(lái)提供模擬器官發(fā)生的微環(huán)境的方法[40]。類(lèi)器官模型可用于研究腫瘤細(xì)胞與包括基質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的微環(huán)境之間的互作關(guān)系。未來(lái)的腫瘤類(lèi)器官研究也會(huì)更加注重培養(yǎng)體系的完善, 如加入巨噬細(xì)胞或者淋巴細(xì)胞、血管類(lèi)器官、神經(jīng)元等，使得類(lèi)器官的培養(yǎng)體系更加接近于活體的腫瘤微環(huán)境, 進(jìn)而為研究微環(huán)境與腫瘤之間的關(guān)系提供一個(gè)理想的模型，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供更多支持。