鼻咽癌組織中BLU與cyclin D1和cyclin B1的表達(dá)及其臨床意義

朱振潮，邱前輝，詹建東，張弛

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州 510282； 2. 廣東省人民醫(yī)院 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州 510080)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國(guó)華南地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病部位隱匿，早期癥狀不明顯，且容易較早發(fā)生淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。放療是其最主要的治療手段，雖然隨著影像學(xué)水平和放療技術(shù)的提高，NPC的局部區(qū)域控制率得到明顯的提高，但淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率仍未見明顯下降[2]。因此，尋找NPC發(fā)生發(fā)展的重要靶向標(biāo)志物，對(duì)腫瘤精準(zhǔn)治療及預(yù)后判斷等具有重要的指導(dǎo)意義。

Zinc-finger, MYND-type containing 10 (ZMYND10)，簡(jiǎn)稱為抑癌基因BLU，是在人類染色體3P21.3區(qū)域內(nèi)被檢測(cè)到的第1個(gè)與NPC相關(guān)的抑癌基因[3]。之后在許多關(guān)于BLU的報(bào)道中，BLU基因在眾多腫瘤中頻繁下調(diào)或缺失，提示其可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要靶向因子[4]。cyclin D1是細(xì)胞分裂周期G1間期中最重要的正性調(diào)控因子，研究發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)上調(diào)，將造成G1間期縮短，細(xì)胞會(huì)提前進(jìn)S期，使其進(jìn)程加快、增殖失控，最終導(dǎo)致腫瘤的生成[5]。而cyclin B1由CCNB1基因編碼，是細(xì)胞分裂周期G2/M期中關(guān)鍵的周期蛋白，同樣已被各種研究證明其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用[6]。

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)NPC發(fā)病和預(yù)后的相關(guān)研究越來越多，但是 BLU、cyclin D1和cyclin B1三者在NPC組織中的表達(dá)及臨床意義卻鮮有報(bào)道。因此，我們采用免疫組化法檢測(cè)NPC組織及慢性鼻咽炎(chronic nasopharyngitis, CN)組織中BLU、cyclin D1與cyclin B1的表達(dá)情況，分析其與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系，為揭示NPC發(fā)生發(fā)展的疾病機(jī)制及預(yù)后評(píng)估提供客觀依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集自2009年12月—2011年8月于廣東省人民醫(yī)院就診并進(jìn)行鼻咽部組織活檢且病理確診為NPC患者97例，其中男74例，女23例；年齡17～71歲，平均年齡(50.8±11.4)歲。腫瘤臨床分期采用2010年美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer, AJCC)的分期標(biāo)準(zhǔn)。其中T1 25例、T2 28例、T3 23例、T4分21例；N0 21例， N1～N3 76例；M0 90例，M1 7例。臨床分期中I期14例、II期26例、III期28例、IV期29例。非角化未分化型癌85例，非角化分化型癌7例，低分化鱗狀細(xì)胞癌5例。所有患者在收集標(biāo)本時(shí)，均未接受放療或化療等臨床治療。所有患者確診后行標(biāo)準(zhǔn)化根治性放療加同步化療。所有患者均通過電話和(或)門診復(fù)查的形式進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間自患者鼻咽癌確診后行治療當(dāng)日開始計(jì)算，至最后的隨訪時(shí)間為2016年11月15日，隨訪結(jié)局分別是：死亡、存活及失訪?？傮w生存期(overall survival，OS)指的是標(biāo)準(zhǔn)化治療開始的時(shí)間到患者死亡或最后一次隨訪的時(shí)間。NPC患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均以MRI報(bào)告確定。另外，隨機(jī)選取同期于廣東省人民醫(yī)院耳鼻咽喉科門診行鼻咽部活檢病理證實(shí)為CN組織標(biāo)本，共36例，其中男24例，女12例；年齡19～58歲，平均年齡(32.4±10.3)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 檢測(cè)方法

組織石蠟包埋后常規(guī)2 um切片，67℃烤片2 h。二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化處理。然后用枸櫞酸鈉緩沖溶液進(jìn)行抗原修復(fù)，用3%過氧化氫孵育10分鐘以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，將BLU、cyclin B1和cyclin D1(Abcam，USA，兔抗)均以1∶100濃度稀釋液滴加到每張切片上，于4℃冰箱過夜。滴加二抗，37℃孵育20 min，PBS液漂洗后滴加DAB溶液顯色5 min。蘇木素復(fù)染后封片觀察。上述操作以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 檢測(cè)結(jié)果判定

采取獨(dú)立雙盲法判定免疫組化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具體為由兩位具有10年或以上病理診斷工作經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師分別進(jìn)行獨(dú)立閱片，隨機(jī)在顯微鏡200倍鏡下進(jìn)行評(píng)估。根據(jù)切片的染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞率得分之積進(jìn)行判斷。其中染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：無著色0分，弱著色(淺黃色)1分，中等著色(棕黃色)2分，強(qiáng)著色(黃褐色)3分。陽(yáng)性細(xì)胞率判斷方法為為：陽(yáng)性細(xì)胞≤5%：0分，6%≤陽(yáng)性細(xì)胞≤25%：1分，26%≤陽(yáng)性細(xì)胞≤50%：2分，陽(yáng)性細(xì)胞>50%：3分。兩項(xiàng)乘積結(jié)果為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為陰性(-)，1～4分弱陽(yáng)性(+)，5～8分中等陽(yáng)性(++)，9～12分強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，按照上述評(píng)分方法判斷出的弱陽(yáng)性、中等陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性均標(biāo)記為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用SPSS 22.0(version 22.0, Inc, Chicago, IL, USA)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組陽(yáng)性率比較采用χ2檢驗(yàn)或確切檢驗(yàn)法(Fisher法，n<5時(shí))，兩種蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法。以Kaplan-Meier法計(jì)算患者總生存率，繪制出生存曲線，進(jìn)一步采用Log-rank檢驗(yàn)比較各組生存率的差異，最后采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析，觀察影響NPC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

2 結(jié)果

2.1 BLU與cyclin D1、cyclinB1在NPC及CN組織中的表達(dá)情況

BLU在NPC或CN組織的陽(yáng)性反應(yīng)使細(xì)胞呈黃褐色或棕黃色，陽(yáng)性表達(dá)主要定位在細(xì)胞漿為主。BLU在NPC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為67.0%(65/97)，而在CN組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為88.9%(32/36)，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.366，P=0.008)；cyclin D1主要表達(dá)在NPC組織細(xì)胞中的細(xì)胞漿或細(xì)胞核，其在NPC組織的陽(yáng)性表達(dá)率為64.9%(63/97)，而CN組織的陽(yáng)性表達(dá)率為27.8%(10/36)，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.651，P<0.001)；cyclin B1在NPC組織的表達(dá)在細(xì)胞漿或細(xì)胞核，其在NPC組織中陽(yáng)性表達(dá)率為60.8%(59/97)，在CN組織的陽(yáng)性表達(dá)率則為22.2%(8/36)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.651，P<0.001)。具體見表1、圖1～3。

表1 BLU、cyclin D1和cyclin B1在NPC和CN組織中的表達(dá)

圖1 BLU在NPC組織和CN組織中的表達(dá) (SP ×200) 1A：BLU在NPC組織低表達(dá)；1B：BLU在CN組織高表達(dá) 圖2 cyclin D1在NPC組織和CN組織中的表達(dá) (SP ×200) 2A：cyclin D1在NPC組織高表達(dá)；2B：cyclin D1在CN組織組織低表達(dá) 圖3 cyclin B1在NPC組織和CN組織中的表達(dá) (SP ×200) 3A：cyclin B1在NPC組織高表達(dá)；3B：cyclin B1在CN組織低表達(dá)

2.2 BLU與cyclin D1、cyclin B1在NPC組織中表達(dá)及臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

NPC組織中BLU表達(dá)與年齡、T分期有相關(guān)性(P<0.05)，與性別、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)；cyclin D1表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P<0.05)，與性別、年齡、T分期、病理類型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及生存狀態(tài)無關(guān)(P>0.05)；cyclin B1表達(dá)與臨床分期與T分期有相關(guān)性(P<0.05)，與性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及生存狀態(tài)無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 97例NPC組織中BLU、cyclin D1和cyclin B1表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 (例)

2.3 BLU與cyclin B1、cyclin D1在NPC組織中表達(dá)相關(guān)性

采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法三者的相關(guān)性，結(jié)果顯示：BLU與cyclin D1在NPC組織中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.378,P=0.011)，BLU與cyclin B1在NPC組織中表達(dá)無明顯相關(guān)性(r=0.096,P=0.089)，cyclin D1與cyclin B1在NPC組織中表達(dá)無相關(guān)性(r=0.084,P=0.191)。

2.4 BLU與cyclin B1、cyclin D1在NPC組織中表達(dá)與預(yù)后關(guān)系

本研究首先采用Kaplan-Meier法對(duì)納入的患者進(jìn)行總體生存率估計(jì)，其中5年累積生存率為75%，中位生存期為70個(gè)月。BLU表達(dá)陽(yáng)性組的生存率高于表達(dá)陰性組，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見圖4。cyclin D1組表達(dá)陽(yáng)性組生存率低于表達(dá)陰性組，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見圖5。cyclin B1組表達(dá)陽(yáng)性組與表達(dá)陰性組生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),見圖6。

圖4 抑癌基因BLU不同表達(dá)患者的生存曲線

圖5 cyclin D1不同表達(dá)患者的生存曲線

圖6 cyclin B1不同表達(dá)患者的生存曲線

進(jìn)一步采用Log-rank法(單因素分析)研究BLU與cyclin B1、cyclin D1的表達(dá)及各臨床病理參數(shù)對(duì)NPC患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示：BLU、cyclin D1、T分期、N分期與患者的預(yù)后有關(guān)，而年齡、性別、臨床分期、病理類型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與患者的預(yù)后無關(guān)。

最后采用Cox回歸模型(多因素分析)顯示BLU、cyclin D1及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是NPC預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，其余年齡、性別、臨床分期、T分期、病理類型和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移不能單獨(dú)預(yù)測(cè)疾病的預(yù)后。見表3。

表3 NPC患者Cox回歸風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析結(jié)果

3 討論

抑癌基因BLU全稱為Zinc-finger, MYND-type containing 10 (ZMYND10)，其蛋白的結(jié)構(gòu)包含MYND結(jié)構(gòu)域的C端區(qū)域，該域由幾個(gè)半胱氨酸和組氨酸氨基組成的殘基[7]。BLU在很多正常人組織類型中具有高度表達(dá)，而在許多惡性腫瘤中表達(dá)明顯下調(diào)。本研究同樣證實(shí)，BLU在NPC組織表達(dá)下調(diào)，與目前普遍的研究結(jié)果一致[8-10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BLU表達(dá)水平與年齡、T分期有相關(guān)性。這提示BLU表達(dá)下調(diào)，可能與NPC局部浸潤(rùn)有關(guān)，并促進(jìn)臨床分期進(jìn)展。BLU與NPC患者年齡相關(guān)，提示可能隨著年齡增大而BLU下降，具體的機(jī)制仍有待闡明，目前仍無相似研究結(jié)果。而國(guó)外學(xué)者研究顯示[10]，BLU在NPC組織中表達(dá)與組織病理類型相關(guān)，與本研究不一致，可能是實(shí)驗(yàn)方法不同或人種差異所致。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，BLU高表達(dá)組的生存率高于低表達(dá)組，進(jìn)行單因素和多因素分析同樣顯示BLU與NPC預(yù)后相關(guān)，可能是NPC預(yù)后獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。我們認(rèn)為，BLU可能成為NPC預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一，本研究初步提供了客觀實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但仍需臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究顯示，cyclin D1在NPC組織的陽(yáng)性表達(dá)率與CN組織的陽(yáng)性表達(dá)率相比明顯升高，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)cyclin D1表達(dá)水平與臨床分期與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，并且單因素及多因素分析提示其是NPC預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子?？v觀文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，許多惡性腫瘤包括食管癌、卵巢癌、乳腺癌以及頭頸部癌等的諸多研究都報(bào)道了cyclin D1表達(dá)水平的升高[11-12]，與本研究較為一致。同樣地，國(guó)內(nèi)外一些體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明，cyclin D1高表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)生長(zhǎng)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13]。這強(qiáng)烈提示，cyclin D1在惡性腫瘤中異常高表達(dá)，可能使G1間期提前進(jìn)S期，造成細(xì)胞失控性增殖。我們的研究顯cyclin D1是NPC預(yù)后的獨(dú)立影響因素，其表達(dá)升高可能與NPC患者不良預(yù)后相關(guān)，可能成為NPC預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一。

cyclin B1在正常組織細(xì)胞中表達(dá)水平極低，僅于細(xì)胞間期G2/M轉(zhuǎn)變時(shí)期一過性急劇升高，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程[14]。本研究中，cyclin B1在NPC組織的陽(yáng)性表達(dá)率高于CN組織的陽(yáng)性表達(dá)率，與國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道一致，因此我們推測(cè)其表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞周期不受限制，從而腫瘤發(fā)生發(fā)展。另外，cyclin B1表達(dá)水平與臨床分期、局部浸潤(rùn)有相關(guān)性，最后進(jìn)行預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，cyclin B1并不能預(yù)測(cè)NPC患者的預(yù)后情況。但文獻(xiàn)回顧可以發(fā)現(xiàn)，眾多研究提示cyclin B1是一種有價(jià)值的預(yù)后指標(biāo)，也是實(shí)體瘤的潛在治療靶點(diǎn)[6]。而我們的研究表明，細(xì)胞cyclin B1表達(dá)與NPC預(yù)后無明顯相關(guān)性，與大多數(shù)實(shí)體瘤研究結(jié)果不一致，可能是不同研究方法和樣本量差異所致。因此，cyclin B1在惡性腫瘤中被廣泛研究，而研究結(jié)果又有所差別。正是這些差異表明，進(jìn)一步研究cyclin B1，有助于闡明其在不同腫瘤類型的發(fā)病機(jī)制和預(yù)后價(jià)值。

本研究擬采用Spearman相關(guān)分析方法發(fā)現(xiàn)，BLU與cyclin D1在NPC組織中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，這可能提示NPC中BLU表達(dá)下調(diào)可能促使cyclin D1高表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞分裂周期失控，從而腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展。Zhang等[15]通過體外實(shí)驗(yàn)表明，BLU基因高表達(dá)能抑制JNK信號(hào)通路的活性，降低cyclin D1的表達(dá)水平，從而使細(xì)胞周期阻滯于G1，明顯抑制NPC細(xì)胞克隆形成。另有Park等[16]研究發(fā)現(xiàn)，BLU增強(qiáng)了化療藥紫杉醇對(duì)腫瘤的抑制作用，其通過減少細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1、cyclin B1，同時(shí)促進(jìn)p16和p27表達(dá)，誘導(dǎo)G2/M期的細(xì)胞周期停滯。類似地，Zhou等[17]的研究顯示，BLU通過抑制NF-κB通路增強(qiáng)了死亡受體誘導(dǎo)，認(rèn)為BLU通過增強(qiáng)抗腫瘤免疫力來抑制腫瘤形成。還有研究采用PCR列陣法，發(fā)現(xiàn)BLU基因的過表達(dá)與NPC細(xì)胞中的血管生成網(wǎng)絡(luò)相關(guān)，提示BLU可能直接參與了NPC發(fā)展的微環(huán)境和抗新生血管生成活動(dòng)[9]。

綜上所述，BLU表達(dá)下調(diào)，而cyclin B1和cyclin D1高表達(dá)，可能在NPC發(fā)生發(fā)展中產(chǎn)生重要作用，而BLU與cyclin D1有可能成為其中評(píng)估NPC預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。但BLU、cyclin D1和cyclin B1如何互相影響，信號(hào)通路中上下游分子不同表達(dá)，仍未得到驗(yàn)證，未來我們將驗(yàn)證該基因的信號(hào)通路，為闡述NPC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及預(yù)后評(píng)估提供更完善的客觀依據(jù)。