離子色譜法測定牛肉中亞硝酸鹽含量的不確定度評定

孫 麗，劉 薔

(淮安市食品藥品檢驗所，江蘇 淮安 223300)

亞硝酸鹽作為防腐劑和著色劑被允許用于肉制品的生產(chǎn)加工，可為肉制品保鮮增色。亞硝酸鹽對人體的危害已得到廣泛重視，科研工作者已開展多種途徑減少和消除亞硝酸鹽的研究，并取得了一定的成果[1-4]。亞硝酸鹽每日允許攝入量(ADI)為0～0.07 mg/kg.BW[5]，若過量攝入會對人體健康造成許多不利影響。亞硝酸鹽對人體的危害主要有兩方面：一是亞硝酸鹽本身的毒性，可引起高鐵血紅蛋白癥，使血液失去攜帶氧氣的功能，從而使人出現(xiàn)缺氧中毒癥狀，嚴(yán)重時還會因呼吸衰竭而危及生命[6]；二是亞硝酸鹽還會在人體內(nèi)與二級胺反應(yīng)生成亞硝胺[7]，而亞硝胺可以引發(fā)肝癌、食管癌、胃癌等多種癌癥[8-10]。因此控制肉制品中的亞硝酸鹽含量對食品安全意義重大。

為評定亞硝酸鹽檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，實驗室通常采用不確定度進行說明。本文依據(jù)測量不確定度評定準(zhǔn)則[11-14]，采用規(guī)范方法，對樣品中亞硝酸鹽含量進行測定，建立了離子色譜法測定醬鹵肉制品中亞硝酸鹽的不確定度評定方法，通過分析不確定度的來源，尋找影響檢測結(jié)果的關(guān)鍵因素，為提高亞硝酸鹽的檢測水平提供了參考依據(jù)，對保護人們的生命健康具有至關(guān)重要的意義。

1 實 驗

1.1 儀器設(shè)備

戴安ICS-5000+離子色譜儀，戴安公司；XS205DU電子天平，METTLER TOLEDO公司；MULTIFUGE-X1R高速冷凍離心機，ThermoFisher儀器有限公司；KH7200DE超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；GenPure Pro超純水機，ThermoFisher；刻度吸量管，1 mL，5 mL；單標(biāo)線吸量管，1 mL，2 mL；容量瓶，20 mL，100 mL。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品

亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液：國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

1.3 測定方法

依據(jù)GB 5009.33-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

用1 mL移液管移取1 mL 1000 mg/L亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液到100 mL容量瓶中得10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)中間液。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制Table 1 Standard curve preparation

1.5 樣品測定液的制備

樣品經(jīng)粉碎至勻漿，稱取試樣5 g置于150 mL具塞錐形瓶中，加入80 mL水， 超聲提取30 min，每隔5 min振搖1次，保持固相完全分散。于75 ℃水浴中放置5 min，取出放置至室溫，定量轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。溶液經(jīng)濾紙過濾后，取部分溶液于10000 r/min離心15 min，上清液備用。

取上述備用溶液約15 mL，通過0.22 μm水性濾膜針頭濾器、C18柱，棄去前面3 mL，收集后面洗脫液待測。固相萃取柱使用前需進行活化，C18柱、Ag柱和Na柱,其活化過程為：C18柱使用前依次用10 mL甲醇、15 mL水通過，靜置活化30 min。Ag柱和Na柱用10 mL水通過，靜置活化30 min。同時做空白試驗。

1.6 數(shù)學(xué)模型的建立

式中:X——亞硝酸鹽的含量，mg/kg

C——上機液中亞硝酸鹽含量，mg/L

V——樣品定容體積，mL

m——樣品質(zhì)量，g

1.5——亞硝酸根離子換算為亞硝酸鹽(按亞硝酸鈉計)的折算系數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 不確定度的分析與評定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引起的不確定度urel(c0)

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合計算結(jié)果Table 2 Standard curve fitting calculation results

配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，每一濃度測定2次，以亞硝酸鹽的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出的線性方程為y=0.4746x-0.0028，相關(guān)擬合系數(shù)(r)為0.9999，斜率(b)為0.4746，截距(a)為-0.0028。對同一樣品進行了2次測量，濃度平均值為1.09 mg/L。

對C0進行2次測定，由吸收率通過直線方程求得C0=1.09 mg/L，則C0的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置引入的相對不確定度urel(c標(biāo))

2.1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度urelp

2.1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液配置引入的不確定度urelmed

將儲備液1000 mg/L按1:100，得到10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液。1:100稀釋是采用1 mL單標(biāo)線吸量管和100毫升容量瓶來完成，對1 mL單標(biāo)線吸量管和100 mL容量瓶進行不確定度分析。

溫度波動引起的1 mL單標(biāo)線吸量管引入的不確定度為：

溫度波動引起的100 mL容量瓶引入的不確定度為：

結(jié)合(1)(2)(3)中間液合成相對不確定度urelmed

2.1.2.3 獲得標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urelw

表3 吸量管和容量瓶[15-17]引入的不確定度Table 3 Uncertainty introduced by pipette and volumetric flask

根據(jù)表3各分量相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果，求得標(biāo)準(zhǔn)溶液濃相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

=0.0074

綜上，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度引入不確定度

=0.0089

2.1.3 樣品制備過程中產(chǎn)生的不確定度urel(c樣)

2.1.3.1 樣品稱重引起的不確定度urel(m樣)

該天平稱量時重復(fù)性最大允許誤差為1.0 e，即1.0 mg，重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度：

單次稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

天平秤量兩次：

樣品稱量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(m樣)=u(樣)/m樣=0.912/5002.6=0.000182

2.1.3.2 樣品定容引起的不確定度urel(V)樣

結(jié)合(1)、(2)樣品定容帶來的不確定度：

綜上，樣品制備時產(chǎn)生的不確定：

2.1.4 重復(fù)測定引入的不確定度urel(rep)

樣品平行測定7次，測定結(jié)果分別為1.098、1.029、1.066、1.085、1.072、1.091、1.089 mg/L，平均值1.076 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)偏差Srep=0.0234 mg/L，正常測定2次。

2.1.5 合成相對不確定度

各合成不確定度分量列表，見表4。

表4 相對不確定度匯總表Table 4 Summary table of relative uncertainty

各相對不確定度進行合成：

=0.062

2.2 測試結(jié)果及不確定結(jié)果的表述

牛肉中亞硝酸鹽含量為32.28 mg/kg，因此，

u(c)=32.28×0.062=2.0 mg/kg

95%包含概率下包含因子K=2，擴展不確定度為：

U=K×u(c)=2×2.0=4.0 mg/kg

牛肉中亞硝酸鹽含量為：

C=(32.3±4.0) mg/kg,K=2

3 結(jié) 論

本文采用GB 5009.33-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》建立離子色譜法對牛肉中亞硝酸鹽含量進行測定。通過對校準(zhǔn)曲線擬合、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、樣品的制備、測試重復(fù)性四個方面進行不確定度評定，牛肉中亞硝酸鹽不確定度貢獻主要來源于標(biāo)準(zhǔn)溶液配制，特別是標(biāo)準(zhǔn)工作液對不確定度影響較大。因此，在實驗過程中為獲得準(zhǔn)確的測定結(jié)果，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的時候，各個標(biāo)曲點正確配制，并做到規(guī)范操作，減小曲線配制過程中產(chǎn)生的不確定度，消除誤差，以保證測量結(jié)果有更高的準(zhǔn)確度。