HPLC測定婦樂顆粒中10個成分的含量

駱海春，姚起艷，陳高健，張雪梅

（北海市食品藥品檢驗所，廣西 北海 536000）

婦樂顆?，F(xiàn)收載于2020年版《中華人民共和國藥典》一部，是由忍冬藤、大血藤、甘草、大青葉、蒲公英、牡丹皮、赤芍、川楝子、醋延胡索和熟大黃10味藥材加工而成的中成藥，具有清熱涼血，化瘀止痛之功效，臨床用于瘀熱蘊結(jié)所致的帶下病及慢性盆腔炎等癥[1]。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅對熟大黃中的大黃酚、大黃素進行含量控制，相關(guān)文獻也僅針對方中個別藥材中的單一指標(biāo)成分開展研究[2-4]。婦樂顆粒方中藥味較多，化學(xué)成分復(fù)雜，單一指標(biāo)難以全面反映藥品內(nèi)在質(zhì)量。為更客觀、全面地評價和控制婦樂顆粒質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜（HPLC）波長切換法同時測定婦樂顆粒中綠原酸、馬錢苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸銨、大黃酚、大黃素、芍藥苷、川楝素和延胡索乙素的含量，以期為提高和完善婦樂顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；BT125D型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；BX7200HP型超聲波清洗器（濟寧魯超儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

婦樂顆粒（規(guī)格：6 g/袋；批號：20191205，20200822，20200716，20200628，20200609；湖北襄陽隆中藥業(yè)集團有限公司）；芍藥苷對照品（批號：110736-201943，純度：95.1 %），綠原酸對照品（批號：110753-202018，純度：96.1 %），馬錢苷對照品（批號：111640-201808，純度：99.0 %），咖啡酸對照品（批號：110885-201703，純度：99.7 %），甘草苷對照品（批號：111610-201908，純度：95.0 %），延胡索乙素對照品（批號：110726-201819，純度：99.6 %），川楝素對照品（批號：111842-201804，純度：96.9 %），甘草酸銨對照品（批號：110731-202021，純度：96.2 %），大黃酚對照品（批號：110796-201922，純度：99.4 %），大黃素對照品（批號：110756-201913，純度：96.0 %，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、甲醇均為色譜純，其他試劑為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品儲備液及混合對照品溶液的制備 取綠原酸、馬錢苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸銨、大黃酚、大黃素、芍藥苷、川楝素和延胡索乙素對照品各適量，精密稱定，加70 %甲醇，超聲使溶解，制成每1 ml含綠原酸1.1150 mg、馬錢苷0.2640 mg、咖啡酸0.2010 mg、甘草苷0.5488 mg、甘草酸銨0.3112 mg、大黃酚0.3034 mg、大黃素0.3616 mg、芍藥苷0.8962 mg、川楝素0.1106 mg和延胡索乙素0.8204 mg的對照品儲備液。

精密量取上述儲備液2 ml，置100 ml量瓶中，加70 %甲醇，制成每1 ml含綠原酸22.30 μg、馬錢苷5.28 μg、咖啡酸4.02 μg、甘草苷10.98 μg、甘草酸銨6.22 μg、大黃酚6.07 μg、大黃素7.23 μg、芍藥苷17.92 μg、川楝素2.21 μg和延胡索乙素16.41 μg的混合對照品溶液，搖勻，過濾，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取婦樂顆粒適量，研細(xì)，稱取約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70 %甲醇50 ml，稱定重量，超聲（功率：400 W，頻率：50 kHz）提取50 min，放至室溫，再次稱定重量，用70 %甲醇補足減失重量，搖勻，過濾，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備 按婦樂顆粒處方工藝制備缺忍冬藤、大血藤、甘草、牡丹皮、赤芍、川楝子、醋延胡素和熟大黃的陰性樣品，按2.1.2項下方法制備，即得。

2.2 色譜條件及專屬性試驗

色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1 %磷酸溶液（B），流速：1.0 ml/min，梯度洗脫（0～12 min，24 %A→41 %A；12～37 min，41 %A→63 %A；37～51 min，63 %A→35 %A；51～60 min，35 %A→24 %A）。檢測波長：0～12 min，327 nm（綠原酸、咖啡酸）；12～38 min，237 nm（芍藥苷、馬錢苷、甘草苷、甘草酸銨）；38～46 min，254 nm（大黃素、大黃酚）；46～60 min，208 nm（川楝素、延胡索乙素）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。精密吸取2.1.1項下混合對照品溶液，2.1.2項下供試品溶液和2.1.3項下陰性樣品溶液，按上述色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，色譜圖基線平穩(wěn)，綠原酸、馬錢苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸銨、大黃酚、大黃素、芍藥苷、川楝素和延胡索乙素與相鄰色譜峰分離完全（分離度＞1.5），各待測成分的理論塔板數(shù)均＞4000，陰性樣品對10個指標(biāo)成分檢測無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 專屬性試驗HPLC色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.1.1項下混合對照品儲備液1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 ml，置于200 ml量瓶中，加70 %甲醇定容至刻度，即得系列濃度混合對照品溶液。按2.2項色譜條件進樣分析，以各待測成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/ml），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果綠原酸、馬錢苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸銨、大黃酚、大黃素、芍藥苷、川楝素和延胡索乙素在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 10種有效成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.2 精密度考察 精密吸取2.1.1項下混合對照品溶液，按2.2項色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算各待測成分峰面積RSD。結(jié)果，綠原酸、馬錢苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸銨、大黃酚、大黃素、芍藥苷、川楝素和延胡索乙素峰面積RSD分別為1.37 %，0.89 %，1.02 %，0.67 %，1.19 %，1.11 %，0.93 %，1.25 %，0.74 %，0.64 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性考察 取同一批婦樂顆粒（批號：20191205），按2.1.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.2項色譜條件下進樣分析，記錄色譜圖，計算各待測成分含量及其RSD。結(jié)果綠原酸、馬錢苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸銨、大黃酚、大黃素、芍藥苷、川楝素和延胡索乙素平均含量分別為1.1523，0.2544，0.1987，0.5412，0.3124，0.2977，0.3456，0.9176，0.0947，0.7568 mg/g，RSD分別為0.90 %，0.68 %，1.05 %，1.13 %，1.36 %，1.27 %，0.47 %，0.93 %，1.10 %，0.88 %（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 取同一批婦樂顆粒（批號：20191205），按2.1.2項下方法制備后，分別于0，2，4，8，16，24，36，48 h，按2.2項色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸、馬錢苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸銨、大黃酚、大黃素、芍藥苷、川楝素和延胡索乙素峰面積的RSD分別為1.34 %，0.87 %，1.62 %，0.84 %，1.64 %，0.87 %，0.69 %、1.25 %，1.37 %，0.96 %（n=6），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取2.3.3項下樣品0.5 g，共6份，精密稱定，分別置于50 ml量瓶中，精密加入2.1.1項下對照品儲備液0.5 ml，再按2.1.2項下方法制備溶液，按2.2項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，計算綠原酸、馬錢苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸銨、大黃酚、大黃素、芍藥苷、川楝素和延胡索乙素加樣回收率及RSD。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

表2（續(xù)）

2.3.6 耐用性考察 在相同條件下，考察不同流速（0.8，1.0，1.2 ml/min）、不同色譜柱溫度（25，30，35 ℃）和不同色譜柱型號（Agilent TC-C18、Diamond C18、Waters C18，規(guī)格：250 mm×4.6 mm，5 μm）。結(jié)果不同流速和柱溫對10個指標(biāo)成分色譜峰峰形和出峰時間影響較大（RSD＞5.0 %），故試驗中應(yīng)注意控制流速和色譜柱的溫度；不同廠家的色譜柱對色譜峰的峰形及出峰時間影響較?。≧SD＜1.0 %），各指標(biāo)成分均能基線分離。

2.4 樣品含量測定

取5批婦樂顆粒，分別按2.1.2項下方法制備供試品溶液。將各供試品溶液和2.1.1項下混合對照品溶液依法進樣分析，記錄峰面積，按外標(biāo)法計算各樣品中綠原酸、馬錢苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸銨、大黃酚、大黃素、芍藥苷、川楝素和延胡索乙素的含量。結(jié)果見表3。

表3 婦樂顆粒中各待測成分的含量（n=3）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

婦樂顆粒由忍冬藤、大血藤、甘草、大青葉、蒲公英、牡丹皮、赤芍、川楝子、醋延胡索和熟大黃10味藥材配伍而成。方中忍冬藤、大血藤、蒲公英富含以綠原酸，咖啡酸為代表的有機酸類物質(zhì)，這類物質(zhì)具有抗菌，抗病毒，抗炎鎮(zhèn)痛，抗腫瘤等功效[5-7]；方中牡丹皮和赤芍均含有以芍藥苷為代表的單萜苷類物質(zhì)，這類物質(zhì)具有止痛、抗炎、保肝及多途徑抑制自身免疫反應(yīng)等多種藥理作用[8-9]；研究表明，川楝子中的三萜類化合物具有驅(qū)蟲、抗菌、抗炎、抗癌、抗乳腺增生等作用，川楝素是川楝子中含量較高的三萜類物質(zhì)；醋延胡索中的延胡索乙素等生物堿類物質(zhì)具有活血，行氣，止痛之療效，常用于脘腹疼痛，胸痹心痛，經(jīng)閉痛經(jīng)，產(chǎn)后瘀阻等癥[10]；甘草具有補脾益氣，清熱解毒，緩急止痛，調(diào)和諸藥之功效，臨床應(yīng)用范圍廣[11]。熟大黃具有消腫止痛，散瘀止血之功效，婦樂顆粒現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是以熟大黃中蒽醌類物質(zhì)大黃酚、大黃素作為活性指標(biāo)進行含量控制[12]。結(jié)合2020年版中國藥典一部中分別以綠原酸和馬錢苷、咖啡酸、甘草苷和甘草酸銨、延胡索乙素、芍藥苷、大黃酚和大黃素作為忍冬藤、蒲公英、甘草、醋延胡索、赤芍和熟大黃含量測定項下的指標(biāo)成分[1]，試驗以綠原酸、馬錢苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸銨、大黃酚、大黃素、芍藥苷、川楝素和延胡索乙素作為指標(biāo)成分。以多味藥材中多種活性成分作為檢測指標(biāo)，較單味藥材、單一成分可更全面、準(zhǔn)確地評價藥品內(nèi)在質(zhì)量。

3.2 提取方法的優(yōu)化[13-14]

因待測成分較多，不同的溶媒對不同物質(zhì)溶解性存在差異。試驗以10種活性成分色譜峰的峰面積作為評價指標(biāo)，分別考察了水、乙醇、甲醇3種溶媒對10種成分提取率的影響。發(fā)現(xiàn)以甲醇作為溶媒時提取較完全，但雜質(zhì)峰較多，摸索不同比例的甲醇溶液，結(jié)果以70 %甲醇溶液作為溶媒，提取完全，且雜質(zhì)峰較少，各色譜峰分離度均＞1.5。試驗分別考察超聲處理（功率：400 W，頻率：50 kHz）和加熱回流兩種提取方式及不同提取時間對各成分溶出率的影響，結(jié)果兩種提取方式均可提取完全，考慮試驗易操作性，選擇超聲處理50min作為樣品處理方式。

3.3 色譜條件的選擇

試驗采用二極管陣列檢測器在210～400 nm范圍內(nèi)對對照品溶液進行光譜掃描，參考相關(guān)文獻[15-16]并結(jié)合各成分出峰時間的先后順序，最終采用波長切換法，在327 nm波長處檢測綠原酸和咖啡酸，在237 nm波長處檢測芍藥苷、馬錢苷、甘草苷和甘草酸銨，在254 nm波長處檢測大黃素、大黃酚，在280 nm波長處檢測川楝素、延胡索乙素。試驗考察了不同流動相體系[13,15-16]，有機相甲醇的分離能力優(yōu)于乙腈，在水相中加入適量的酸性物質(zhì)可有效改善色譜峰拖尾現(xiàn)象。試驗以各色譜峰的對稱因子、分離度和理論塔板數(shù)為評價指標(biāo)，考察了甲醇-0.1 %冰醋酸水溶液、甲醇-0.1 %甲酸水溶液和甲醇-0.1 %磷酸水溶液的分離效果。結(jié)果以甲醇-0.1 %磷酸溶液為流動相梯度洗脫時，10個活性成分色譜峰峰形最佳。

4 結(jié)論

試驗建立了一種可同時測定婦樂顆粒中綠原酸、馬錢苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸銨、大黃酚、大黃素、芍藥苷、川楝素和延胡索乙素10個化學(xué)成分的HPLC方法，該方法操作便捷，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性高，可用于婦樂顆粒的質(zhì)量控制。