豨薟草提取物不同萃取部位對小鼠鎮(zhèn)靜催眠作用的研究

李 清，瞿發(fā)林*，陳 穎，董文燊，郭宜銀，汪慧賢

(1.聯(lián)勤保障部隊第九〇四醫(yī)院藥劑科，江蘇常州 213003；2.南京中醫(yī)藥大學翰林學院藥學院，江蘇泰州225300)

睡眠是人類日常生活必不可少的一種生理需求。然而，由于生活節(jié)奏加快和生活壓力增大，失眠成了現(xiàn)代社會常見的一種疾病，成為影響人類健康的重要問題之一。失眠癥是以長期入睡困難或睡眠持續(xù)困難并導致睡眠質(zhì)量下降為主要特征的疾病。研究表明，中國成年人失眠率高達38.2%[1]。目前，治療失眠的藥物仍以化學合成類藥物為主，長期服用會產(chǎn)生成癮性、耐藥性等毒副作用。因此，越來越多的研究者致力于中藥鎮(zhèn)靜催眠作用的研究，以發(fā)現(xiàn)療效好、安全性高的中藥材。

豨薟草為菊科豨薟屬草本植物，又名“肥豬苗”、“黏糊菜”、“風濕草”等，其基源植物包括豨薟(SiegesbeckiaorientalisL.)、腺梗豨薟(S.pubescensMakino)、毛梗豨薟(S.glabrescensMakino)，廣泛分布于全國各地，以地上部分入藥，具有祛風濕、通經(jīng)絡、清熱解毒的功能，可用于治療半身不遂、風疹濕瘡、風濕痹痛、蟲獸咬傷、筋骨不利、腰膝無力[2]。本課題組前期走訪發(fā)現(xiàn)，在我國某些地區(qū)，農(nóng)民用豨薟草喂豬，豬在食用豨薟草后能促進睡眠，減少活動時間，從而體重不斷上升。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，豨薟草提取物具有明顯的鎮(zhèn)靜催眠活性[3]，為了進一步研究其活性部位，本文研究了豨薟草提取物不同萃取部位的鎮(zhèn)靜催眠作用。

1 材 料

1.1 實驗動物 100只SPF級ICR小鼠，雄性，體重為(20±2) g[江蘇省常州市卡文斯實驗動物有限公司提供，實驗動物合格證號：SCXK(蘇)2016-0010]。小鼠在溫度(25±2) ℃、濕度(55±10)%、干凈整潔的環(huán)境中適應性飼養(yǎng)7 d，自由攝取飲用水和標準飼料，保持晝夜正常節(jié)律。

1.2 藥材和試劑 豨薟草提取物(本課題組前期研究所得)；戊巴比妥鈉(Sigma公司，批號191201)；艾司唑侖片(常州四藥制藥有限公司，批號20200111)；生理鹽水(四川美大康佳樂藥業(yè)，批號20010321)。石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等均為分析純。

1.3 儀器和設備 XS105型電子分析天平(梅特勒托利多儀器有限公司)；FQ-1006HTD型超聲波清洗儀(杭州法蘭特超聲波科技有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)； RE-5C式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青浦滬西儀器廠)；CT-C-O型烘箱(常州市范氏干燥設備有限公司)；自制開野實驗敞箱(50 cm×50 cm×30 cm)，箱內(nèi)色調(diào)均為黑色，箱底用白線畫出25個同等面積的方格。

2 方 法

2.1 豨薟草提取物各萃取部位的制備 取適量豨薟草干燥提取物，粉碎，用水溶解后，得到豨薟草提取物混懸液。按照極性由小到大的順序，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇進行液液萃取，萃取液減壓濃縮干燥，得到各萃取部位。石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各部位萃取率分別為5%、10%、10%和20%。

2.2 動物分組和給藥方案 將100只小鼠隨機分成10組：空白對照組，艾司唑侖組(0.8 mg/kg)，石油醚萃取部位低、高劑量組(40、80 mg/kg)，二氯甲烷萃取部位低、高劑量組(80、160 mg/kg)，乙酸乙酯萃取部位低、高劑量組(80、160 mg/kg)，正丁醇萃取部位低、高劑量組(160、320 mg/kg)，每組10只。每天下午17：00灌胃給藥，連續(xù)灌胃8 d。

2.3 小鼠自主活動的測定 在第6天給藥30 min后，保持環(huán)境安靜、無嘈雜，將小鼠放置在開野實驗敞箱中適應1 min，待適應時間結(jié)束后，觀察小鼠在5 min內(nèi)的自主活動，記錄其活動次數(shù)。小鼠的自主活動包括：舔爪、清洗整理身體、擦臉均可記為清洗身體1次；小鼠四肢全部進入1個方格記為水平走格1次；小鼠前肢攀附箱壁或離箱底站立記為站立1次。每只小鼠觀察結(jié)束后，需清理敞箱，以免對下一只小鼠造成不必要的干擾。

2.4 豨薟草提取物各萃取部位與閾上劑量戊巴比妥鈉協(xié)同作用的研究 基于前期研究戊巴比妥鈉劑量的預實驗，選定腹腔注射戊巴比妥鈉溶液的閾上劑量為41 mg/kg。在第7天給藥40 min后，給小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液41 mg/kg，注射后立刻計時，觀察并記錄小鼠的入睡潛伏期和睡眠時長。入睡潛伏期是指小鼠從注射戊巴比妥鈉至翻正反射消失的時間，睡眠時長是指小鼠從翻正反射消失至翻正反射恢復的時間[4-6]。

2.5 豨薟草提取物各萃取部位與閾下劑量戊巴比妥鈉協(xié)同作用的研究 基于前期研究戊巴比妥鈉劑量的預實驗，選定腹腔注射戊巴比妥鈉溶液的閾下劑量為35 mg/kg。在第8天給藥40 min后，給小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液35 mg/kg，觀察小鼠在15 min內(nèi)的睡眠情況。若小鼠翻正反射消失且持續(xù)1 min以上，則認為其進入睡眠狀態(tài)，根據(jù)睡眠小鼠數(shù)量，計算入睡率。入睡率(%)=(進入睡眠小鼠數(shù)量/小鼠總數(shù)量)×100%[7]。

3 結(jié) 果

3.1 豨薟草提取物各萃取部位對小鼠自主活動的影響 各組小鼠自主活動次數(shù)測定結(jié)果見表1。與空白對照組相比，艾司唑侖組(P<0.05)、 石油醚萃取部位高劑量組(P<0.001)、二氯甲烷萃取部位高劑量組(P<0.05)、乙酸乙酯萃取部位低劑量組(P<0.05)、乙酸乙酯萃取部位高劑量組(P<0.05)小鼠的自主活動次數(shù)均顯著降低。由此可見，高劑量石油醚萃取部位，高劑量二氯甲烷萃取部位，低、高劑量乙酸乙酯萃取部位對小鼠均具有明顯的鎮(zhèn)靜作用。

表1 豨薟草提取物不同萃取部位對小鼠自主活動、睡眠時長、入睡潛伏期和入睡率的影響

3.2 豨薟草提取物不同萃取部位對閾上劑量戊巴比妥鈉鎮(zhèn)靜催眠作用的影響 協(xié)同閾上劑量的戊巴比妥鈉時，各組小鼠的睡眠時長和入睡潛伏期測定結(jié)果見表1。與空白對照組相比，艾司唑侖組(P<0.01)、二氯甲烷萃取部位高劑量組(P<0.05)、乙酸乙酯萃取部位高劑量組(P<0.001)小鼠的睡眠時長均顯著增加；艾司唑侖組(P<0.05)、二氯甲烷萃取部位高劑量組(P<0.05)、乙酸乙酯萃取部位高劑量組(P<0.01)小鼠的入睡潛伏期顯著縮短。結(jié)果表明，高劑量二氯甲烷萃取部位和高劑量乙酸乙酯萃取部位具有明顯的鎮(zhèn)靜催眠作用。

3.3 豨薟草提取物不同萃取部位對閾下劑量戊巴比妥鈉鎮(zhèn)靜催眠作用的影響 協(xié)同閾下劑量的戊巴比妥鈉時，各組小鼠的入睡率見表1。與空白對照組相比，艾司唑侖組(P<0.05)、二氯甲烷萃取部位低劑量組(P<0.01)、二氯甲烷萃取部位高劑量組(P<0.01)、乙酸乙酯萃取部位高劑量組(P<0.001)小鼠的入睡率顯著提高，結(jié)果表明低、高劑量二氯甲烷萃取部位和高劑量乙酸乙酯萃取部位具有明顯的鎮(zhèn)靜催眠作用。

4 討 論

豨薟草味辛、苦，性寒，歸肝、腎經(jīng)。曾有報道稱，由于豨薟草味苦、寒，入肝、腎經(jīng)，通過清肝腎郁熱，起到鎮(zhèn)靜安神的作用，可治療頑固性失眠[8]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，豨薟草提取物具有明顯的鎮(zhèn)靜催眠作用，為了進一步深入研究其鎮(zhèn)靜催眠作用的物質(zhì)基礎，本文建立了開野實驗，閾上劑量、閾下劑量戊巴比妥鈉協(xié)同作用實驗等對豨薟草的鎮(zhèn)靜催眠活性部位進行了篩選。開野實驗考察了藥物對小鼠自主活動的影響，從而反映出豨薟草提取物是否具有鎮(zhèn)靜作用，而閾上和閾下劑量戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠實驗則以睡眠潛伏期、睡眠持續(xù)時間和入睡率等指標來評價小鼠的睡眠情況，從而反映豨薟草提取物在體內(nèi)的鎮(zhèn)靜催眠活性。結(jié)果表明，豨薟草石油醚萃取部位高劑量組、二氯甲烷萃取部位高劑量組、乙酸乙酯萃取部位低、高劑量組小鼠的自主活動次數(shù)均顯著降低；二氯甲烷萃取部位高劑量組、乙酸乙酯萃取部位高劑量組小鼠的睡眠時間均顯著延長，并且入睡潛伏期縮短；二氯甲烷萃取部位低、高劑量組，乙酸乙酯萃取部位高劑量組小鼠的入睡率均顯著增加，這表明二氯甲烷萃取部位和乙酸乙酯萃取部位具有顯著的鎮(zhèn)靜催眠作用，是豨薟草發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用的活性部位。此外，豨薟草石油醚萃取部位能顯著減少小鼠的自主活動次數(shù)，但對入睡率、入睡潛伏期和睡眠時長沒有影響，這表明豨薟草的石油醚萃取部位可能僅具有鎮(zhèn)靜作用，并無催眠作用。通過查閱大量文獻，作者根據(jù)化合物的極性推測，豨薟草中的萜類化合物如二萜類和倍半萜類化合物[9]多分布于二氯甲烷和乙酸乙酯萃取部位中。因此， 二氯甲烷和乙酸乙酯萃取部位發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用的物質(zhì)基礎是否與萜類化合物有關，值得進一步深入研究。本研究為探索豨薟草提取物中的鎮(zhèn)靜催眠活性化合物奠定了基礎。