阿爾茨海默病的病理模型及代謝組學(xué)研究進(jìn)展

戴建英，王 輝，劉 敏，洪戰(zhàn)英*

[1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，福州 350122；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海市藥物(中藥)代謝產(chǎn)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433；3.海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433]

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種不可逆、進(jìn)行性發(fā)展的大腦神經(jīng)退行性疾病，可緩慢地破壞記憶力和思維能力，是中老年人癡呆的主要原因[1-2]。AD的特征性病理改變主要是腦部的細(xì)胞外間隙β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積形成老年斑和細(xì)胞內(nèi)異常磷酸化Tau蛋白形成神經(jīng)纖維纏結(jié)。目前關(guān)于AD機(jī)制的研究主要有以下幾種假說(shuō)，即Aβ 毒性、氧化應(yīng)激以及 Tau 蛋白異常磷酸化等。盡管對(duì)于AD的研究比較廣泛，但其確切病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚。因此，為了更好地研究AD發(fā)病機(jī)制，構(gòu)建合理有效的病理模型極為重要。關(guān)于AD的病理模型主要有兩類，一類是動(dòng)物模型，該類模型能夠真實(shí)地反映AD的主要病理學(xué)特征、神經(jīng)生化方面的變化，以及AD行為學(xué)的變化[3]；另一類是細(xì)胞模型，利用該類模型能夠在微觀層面上對(duì)AD的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究[4]。此外，代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的一門學(xué)科，主要研究對(duì)象是作為各種代謝路徑的底物和產(chǎn)物的小分子代謝物，近年來(lái)逐漸應(yīng)用于對(duì)AD的研究中，通過(guò)對(duì)AD病理模型以及患者的內(nèi)源性代謝物進(jìn)行分析，尋找AD的早期診斷標(biāo)志物，探明其發(fā)病機(jī)制。本文擬對(duì)AD相關(guān)的病理模型以及代謝組學(xué)在AD研究中的應(yīng)用進(jìn)行分析總結(jié)，以期為今后的AD發(fā)病機(jī)制研究以及治療藥物研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 AD的動(dòng)物模型

建立理想的動(dòng)物模型模擬人類疾病狀態(tài)，有利于開展AD發(fā)病機(jī)制及防治的深入研究[5]。一個(gè)理想的AD動(dòng)物模型，一方面應(yīng)能充分體現(xiàn)AD的病理特征，另一方面應(yīng)當(dāng)具備記憶和認(rèn)知功能的障礙。目前，AD動(dòng)物模型主要包括衰老模型、轉(zhuǎn)基因模型以及基于膽堿能學(xué)說(shuō)的模型等。

1.1 衰老模型 AD是一個(gè)與年齡有關(guān)的疾病，與衰老有著必然的聯(lián)系。衰老模型主要是促使動(dòng)物衰老進(jìn)而達(dá)到制作AD動(dòng)物模型的目的，其中自然衰老模型是最符合人類衰老特征的一種模型，一般是采用自然衰老的大鼠、小鼠或猴等動(dòng)物[6]，由于需要飼養(yǎng)的時(shí)間較長(zhǎng)，且得到的老齡動(dòng)物無(wú)法全部滿足AD特征，因此自然衰老模型已逐漸被其他模型所代替。

1.1.1 快速衰老模型 快速衰老模型是研究AD最常用的模型，該模型常使用SAMP8小鼠來(lái)構(gòu)建。SAMP8小鼠能夠顯示與年齡有關(guān)的學(xué)習(xí)和記憶障礙，還能夠表現(xiàn)出AD發(fā)病機(jī)制的大多數(shù)特征，包括抗衰老因子、氧化應(yīng)激、炎癥、Aβ沉積、Tau蛋白異常磷酸化等[7]?？箍焖倮匣∈髞喯?R1(SAMR1)常被作為 SAMP8小鼠的正常對(duì)照，在氧化應(yīng)激和炎癥減輕中起作用的轉(zhuǎn)錄因子能夠?qū)AMP8小鼠恢復(fù)為SAMR1表型。這表明SAMP8小鼠的表觀遺傳變化是在大腦水平上實(shí)現(xiàn)保護(hù)作用的關(guān)鍵，可以將SAMP8小鼠用于包括AD在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病的研究[8]。

1.1.2D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老模型 研究表明，小鼠腹腔或皮下注射D-半乳糖可建立衰老和認(rèn)知障礙的模型[9]。腹腔或皮下注射D-半乳糖可導(dǎo)致小鼠發(fā)生記憶障礙、神經(jīng)發(fā)生能力下降、淀粉樣前體蛋白水平升高和氧化損傷。KONG等[10]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠在注射D-半乳糖的5周后表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)緩慢、食物攝入減少、反應(yīng)滯后、無(wú)精打采、皮毛枯萎和無(wú)光澤等明顯的衰老癥狀，這表明建立衰老模型成功。近年來(lái)，有研究表明口服D-半乳糖也可成功建立衰老模型[11]。CHIROMA等[12]用60 mg/kgD-半乳糖和200 mg/kg AlCl3同時(shí)對(duì)大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果大鼠表現(xiàn)出明顯的記憶和學(xué)習(xí)障礙，海馬神經(jīng)元明顯丟失，乙酰膽堿酶活性增加，腦組織內(nèi)Tau蛋白異常磷酸化，成功建立了復(fù)合式動(dòng)物模型，能較好地模擬AD的相關(guān)特征。

1.2 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型 將外源性突變基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物中是建立AD模型較為常用的一種方法。常用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分為兩類：第一類是含有無(wú)效基因的小鼠，即基因敲除小鼠；第二類是AD轉(zhuǎn)基因小鼠，能表達(dá)AD的突變基因，表現(xiàn)出AD的病理學(xué)特征。通過(guò)對(duì)AD轉(zhuǎn)基因小鼠相互雜交，可以附加額外的基因來(lái)創(chuàng)造轉(zhuǎn)雙基因或轉(zhuǎn)多基因小鼠?？紤]到遺傳背景、繁殖能力、操作難度、經(jīng)濟(jì)成本等因素，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物多選用小鼠。現(xiàn)有多種轉(zhuǎn)基因小鼠均可表達(dá)與AD發(fā)病相關(guān)的基因，常用的模型包括APP轉(zhuǎn)基因模型、PS-1轉(zhuǎn)基因模型、Tau轉(zhuǎn)基因模型、轉(zhuǎn)雙基因模型、轉(zhuǎn)多基因模型[13]。

1.2.1 APP轉(zhuǎn)基因模型 神經(jīng)細(xì)胞β-淀粉樣前體蛋白(AβPP)基因APP由于變異，在錯(cuò)誤的位置被酶切，形成Aβ沉淀，是AD的特征病理變化。該模型是利用分子生物學(xué)方法將野生或突變的人源性APP基因?qū)胄∈蟛⒃谛∈蠡蚪M整合、表達(dá)和遺傳。當(dāng)小鼠過(guò)多表達(dá)APP基因或突變基因產(chǎn)物時(shí)，會(huì)引起Aβ異常沉積，導(dǎo)致相關(guān)的病理?yè)p害及癥狀。J20小鼠常被用于構(gòu)建APP轉(zhuǎn)基因模型，其J20轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體是插入到小鼠內(nèi)源性Zbtb20基因座陣列中的16號(hào)染色體上，進(jìn)而達(dá)到破壞成年海馬組織中Zbtb20基因mRNA的目的，且小鼠的內(nèi)源性APP基因也位于16號(hào)染色體上[14]。SAKAKIBARA等[15]為了確定Aβ病理學(xué)相關(guān)的行為改變，使用情境恐懼條件和Morris水迷宮任務(wù)評(píng)估來(lái)對(duì)APP轉(zhuǎn)基因模型小鼠進(jìn)行情感和認(rèn)知能力的考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未插入APP基因的小鼠相比，插入APP基因的小鼠會(huì)更早地出現(xiàn)焦慮等行為，并且學(xué)習(xí)能力也下降了。APP轉(zhuǎn)基因模型是代表臨床前AD的模型，可用于研究AD的預(yù)防，而不是神經(jīng)變性后的治療。值得注意的是，該模型雖然能夠較好地表達(dá)AD的神經(jīng)病理學(xué)特征，包括細(xì)胞外Aβ沉積、老年斑形成、神經(jīng)元突觸丟失等，但是該模型的Aβ沉積和AD患者的Aβ沉積還是有較大的區(qū)別，并且沒有表現(xiàn)出AD患者特有的神經(jīng)元丟失，也未見Tau蛋白磷酸化及神經(jīng)元纖維纏結(jié)。

1.2.2 APP/PS-1轉(zhuǎn)基因模型 APP/PS-1轉(zhuǎn)基因小鼠模型被用于探究AD潛在的病理生理學(xué)特征和尋找新的治療方法，是被廣泛認(rèn)可的一類AD動(dòng)物模型。這種模型復(fù)制了小鼠大腦中β-淀粉樣斑塊的形成，小鼠在8個(gè)月大時(shí)出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)和記憶障礙[16]，但該模型所需的外源性基因表達(dá)缺乏穩(wěn)定性、造模困難并且造價(jià)較高。ZHANG等[17]通過(guò)建立APP/PS-1轉(zhuǎn)基因小鼠模型，研究豐富環(huán)境對(duì)AD小鼠認(rèn)知功能和病理變化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生小鼠相比，AD小鼠模型的行為降低，腦內(nèi)可檢測(cè)到Aβ沉積，乙酰膽堿(Ach)和膽堿轉(zhuǎn)移酶活性降低，而乙酰膽堿酯酶(AchE)活性升高，血清炎癥因子顯著增加，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞因子減少。通過(guò)在豐富環(huán)境中飼養(yǎng)，AD小鼠的活動(dòng)能力和認(rèn)知功能得到改善，Aβ斑塊明顯減少；同時(shí)，血清中的炎癥因子減少，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞因子增加。由此可見，暴露于豐富環(huán)境的APP/PS-1轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)炎癥和膽堿能系統(tǒng)受到影響，可為改善AD的臨床病理特征提供科學(xué)依據(jù)。

1.2.3 Tau蛋白轉(zhuǎn)基因模型 Tau蛋白主要存在于軸突中，同時(shí)也存在于胞體和樹突中。Tau蛋白包含4個(gè)功能域：N-末端投射域、C-末端區(qū)域、富含脯氨酸區(qū)域和微管結(jié)合域。在正常生理?xiàng)l件下，Tau蛋白會(huì)經(jīng)歷翻譯后修飾，包括過(guò)度磷酸化，這將會(huì)影響其與軸突微管結(jié)合的親和力;而在病理?xiàng)l件下，Tau蛋白會(huì)經(jīng)歷過(guò)度的修飾，尤其是過(guò)度磷酸化，這使得Tau蛋白聚集在機(jī)體中并且不易被清除。并且由于Tau基因突變是導(dǎo)致AD的關(guān)鍵因素，因此AD被認(rèn)為是一種Tau病[18]。17號(hào)染色體相聯(lián)帕金森額顳葉癡呆(FTDP-17)是Tau基因遺傳突變導(dǎo)致的癡呆癥，通常發(fā)生在大腦皮層、基底神經(jīng)節(jié)和緣葉。在FTDP-17中，Tau病理發(fā)生在大腦的各個(gè)區(qū)域，并且類型可能不同，臨床癥狀可能包括癡呆、帕金森病和精神病。因此常將人類FTDP-17突變Tau基因?qū)胄∈笾斜磉_(dá)，制作轉(zhuǎn)基因小鼠。AD患者的大腦有Aβ沉積和Tau病理兩個(gè)特征。研究顯示，Tau蛋白對(duì)認(rèn)知功能下降的影響比Aβ發(fā)揮更大的作用[19]。LIPPI等[20]建立了hAPP/hTau小鼠模型，與hTau轉(zhuǎn)基因模型進(jìn)行對(duì)比，hAPP/hTau小鼠模型不論是在空間記憶方面還是行為上，都表現(xiàn)更差，但在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)能力更強(qiáng)。因此，hAPP/hTau小鼠模型可作為探索Aβ沉積和Tau病理對(duì)AD影響的合適的動(dòng)物模型。

1.3 基于膽堿能學(xué)說(shuō)的動(dòng)物模型 研究發(fā)現(xiàn)，AD患者基底前腦、海馬區(qū)、新皮質(zhì)等部位的膽堿能神經(jīng)元明顯減少，神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿缺乏。AD患者認(rèn)知損害的程度與新皮質(zhì)和海馬中乙酰膽堿的減少程度密切相關(guān)[21]。因此，可根據(jù)AD發(fā)病的膽堿能損傷學(xué)說(shuō)，參照動(dòng)物腦立體定位圖譜，通過(guò)定位注射損毀的方式來(lái)制備基底前腦膽堿能系統(tǒng)損傷的AD模型。通常可采用電損毀、外科損毀和化學(xué)損毀三種方法進(jìn)行。電損毀是對(duì)動(dòng)物用電灼傷的方法損毀基底前腦 Meynert 基底核，建立膽堿能損傷的AD模型。外科損毀是利用手術(shù)的方式切斷動(dòng)物的海馬穹隆傘，建立膽堿能損傷的AD模型?；瘜W(xué)損毀則是利用立體定位注射的方法，將興奮性氨基酸如鵝膏蕈氨酸、海仁酸、使君子酸和谷氨酸等注入動(dòng)物的基底前腦 Meynert 基底核，建立膽堿能損傷的AD模型。該模型有記憶功能障礙，但并不出現(xiàn)老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)病理。

1.4 其他模擬AD部分特征的動(dòng)物模型 常用的有鋁元素慢性中毒模型、岡田酸損害模型、Aβ?lián)p害模型以及腦缺血模型。

1.4.1 鋁元素慢性中毒模型 AD動(dòng)物模型腦組織內(nèi)鋁元素的含量較高，導(dǎo)致Tau蛋白和Aβ蛋白在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大腦中積累，使神經(jīng)元變性或凋亡，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成一定損傷[22]。此模型通過(guò)在小鼠側(cè)腦室或腹腔注射三氧化鋁，使小鼠表現(xiàn)出明顯的空間學(xué)習(xí)障礙和記憶損傷。

1.4.2 岡田酸損害模型 岡田酸是蛋白磷酸酶1的抑制劑，蛋白磷酸酶1可以降低Tau蛋白的磷酸化水平，因此可以通過(guò)岡田酸抑制蛋白磷酸酶1，進(jìn)而誘導(dǎo)Tau蛋白過(guò)度磷酸化，建立AD模型[23]。

1.4.3 Aβ?lián)p害模型 Aβ是淀粉樣斑塊形成的主要原因，中樞注射Aβ42干預(yù)可誘導(dǎo)大鼠形成AD樣記憶損傷[24]。該模型是基于 Aβ的神經(jīng)毒性作用，采用立體定位注射的方法將 Aβ注射入大鼠腦部，可引起神經(jīng)毒性反應(yīng)，并產(chǎn)生記憶受損和行為學(xué)障礙。

1.4.4 腦缺血模型 臨床研究表明，患有腦血管疾病的AD患者癡呆的發(fā)展速度更快[25]。人腦的供氧系統(tǒng)對(duì)大腦有重要的保護(hù)作用，缺血、缺氧會(huì)影響腦的正常功能，極易導(dǎo)致智力障礙。通常老年動(dòng)物的腦血流量較成年動(dòng)物減少20% 以上，構(gòu)建老年動(dòng)物慢性腦缺血模型，可以產(chǎn)生類似AD的病理生理改變。

AD動(dòng)物模型的構(gòu)建及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 AD動(dòng)物模型的構(gòu)建及評(píng)價(jià)指標(biāo)

2 AD的細(xì)胞模型

AD的細(xì)胞模型是目前研究AD的神經(jīng)生物學(xué)及神經(jīng)藥理學(xué)的重要手段，具有來(lái)源豐富、干擾因素小、實(shí)驗(yàn)條件易控制、評(píng)價(jià)機(jī)制靈活等特點(diǎn)[26]。常用于建立AD模型的細(xì)胞包括人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)、神經(jīng)腫瘤細(xì)胞NG108-15 細(xì)胞、小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(mouse neuroblastoma cells，N2a)、大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系(rat adrenal pheochromocytoma cell line，PC12)、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human brain microvascular endothelial cells，hBMEC)等。

2.1 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y常被用作神經(jīng)退行性疾病研究的體外模型。SH-SY5Y細(xì)胞來(lái)源于交感神經(jīng)系統(tǒng)，是從未成熟的神經(jīng)元譜系中衍生出來(lái)的。這種細(xì)胞的特點(diǎn)是持續(xù)增殖，表達(dá)未成熟的神經(jīng)元蛋白以及低豐度的神經(jīng)元標(biāo)志物。研究表明，該細(xì)胞能夠分化并獲得完整的神經(jīng)元樣特征[27]，在神經(jīng)細(xì)胞分化之后，SH-SY5Y細(xì)胞表現(xiàn)出一系列的形態(tài)學(xué)和生化變化，包括增殖率的降低、突起的形成和延伸、以及成熟的神經(jīng)元標(biāo)志物的表達(dá)，從而變得更接近原代神經(jīng)元，且SH-SY5Y細(xì)胞能夠表達(dá)出人類蛋白質(zhì)。該細(xì)胞常見的分化方案是通過(guò)向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加維甲酸，待培養(yǎng)基血清含量降低到1%，再加入10 μmol/L維甲酸，不僅能使神經(jīng)突起生長(zhǎng)，而且還會(huì)增加酪氨酸羥化酶、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、神經(jīng)元細(xì)胞核蛋白和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體等神經(jīng)元標(biāo)志物的表達(dá)。其檢測(cè)指標(biāo)主要有細(xì)胞活力、凋亡率及相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)、氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)、Tau 蛋白磷酸化水平等，因此該類細(xì)胞模型主要體現(xiàn)AD的細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、Tau 蛋白磷酸化等病理特征。DE MEDEIROS等[28]將此種細(xì)胞在DMEM/F12培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，使用維甲酸和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子聯(lián)合作用來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，測(cè)定乙酰膽堿酯酶和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性和免疫含量，使用岡田酸刺激分化所得到的細(xì)胞，并評(píng)估其神經(jīng)毒性，成功地建立了一個(gè)可以模擬AD特征的膽堿能神經(jīng)元早期病理生理的體外細(xì)胞模型。

2.2 NG108-15 細(xì)胞 NG108-15 細(xì)胞是由小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤和大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞雜交形成的神經(jīng)腫瘤細(xì)胞。朱美娥[29]將NG108-15細(xì)胞在37 ℃、飽和濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用不同濃度的Aβ25-35對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化后的NG108-15 細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度上升，細(xì)胞活力下降，不同誘導(dǎo)時(shí)間或不同濃度之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且不同濃度Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞在Ca2+濃度上升后5.5～12.1 h，不同時(shí)間顯現(xiàn)出凋亡的典型形態(tài)學(xué)特征。由此可見，由Aβ25-35誘導(dǎo)的NG108-15 細(xì)胞能夠建立理想的AD細(xì)胞模型。除此之外，該細(xì)胞還常用岡田酸來(lái)進(jìn)行誘導(dǎo)分化，用于研究AD的認(rèn)知與記憶等，主要機(jī)制涉及細(xì)胞凋亡、Tau 蛋白異常磷酸化等。

2.3 小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(N2a細(xì)胞) 該模型的建立通常是將N2a細(xì)胞置完全培養(yǎng)基中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，加入20 μmol/L的Aβ25-35進(jìn)行誘導(dǎo)分化，形成所需的AD細(xì)胞模型[30]。除此之外，還可采用 10 mmol/L谷氨酸、0.35 mmol/L甲醛、10 μg/ml 納米二氧化硅(SiNPs)等物質(zhì)對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，進(jìn)而建立AD模型，而經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化后的N2a 細(xì)胞常出現(xiàn) Aβ沉積、Tau 蛋白過(guò)度磷酸化、氧化損傷、細(xì)胞凋亡等AD樣的病理學(xué)特征[31]。

2.4 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系(PC12細(xì)胞) PC12細(xì)胞是一種常用的神經(jīng)細(xì)胞，該細(xì)胞主要分泌產(chǎn)物為多巴胺、去甲腎上腺素等兒茶酚胺類遞質(zhì)，細(xì)胞膜上有神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGF)。受生理水平的NGF誘導(dǎo)后，PC12細(xì)胞停止分裂，長(zhǎng)出神經(jīng)突起，分化為具有交感神經(jīng)元特性的細(xì)胞，常被用于分析神經(jīng)元分化和NGF作用分子機(jī)制的研究，也被用于研究生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞基因表達(dá)改變的機(jī)制，是研究神經(jīng)細(xì)胞生理、病理及藥理的理想模型。YU等[32]利用20 μmol/L Aβ25-35成功地對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，建立了AD體外細(xì)胞模型。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后的PC12細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡以及氧化損傷，表明模型建立成功。TIAN等[33]利用0.5 μmol/L Aβ1-42成功地對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，建立了AD體外細(xì)胞模型，考察了血管緊張素Ⅱ在AD體外細(xì)胞模型中的促凋亡和自噬作用。此外，還常采用10 mmol/L 谷氨酸(Glu)或200 μmol/L H2O2對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化。PC12 細(xì)胞經(jīng)造模試劑誘導(dǎo)后，主要表現(xiàn)出AD氧化損傷、細(xì)胞凋亡等特征。

2.5 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs) iPSCs是一種能保持胚胎干細(xì)胞特性的成體細(xì)胞，可以通過(guò)表達(dá)基因和轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因重組，形成胚胎干細(xì)胞樣狀態(tài)。iPSCs具有分化為神經(jīng)細(xì)胞類型和/或神經(jīng)類器官的獨(dú)特能力，因此iPSCs可用于制備AD體外細(xì)胞模型[34]?，F(xiàn)有的AD模型中，只有轉(zhuǎn)基因模型提供了有關(guān)家族性疾病機(jī)制的信息，但尚未證明其可預(yù)測(cè)藥物開發(fā)。iPSCs模型可能為研究家族性AD以及開發(fā)新的、個(gè)性化的預(yù)防AD的神經(jīng)保護(hù)療法提供途徑。用iPSCs建立的AD細(xì)胞模型會(huì)出現(xiàn)Aβ和Tau蛋白水平的變化，Tau蛋白過(guò)度磷酸化狀態(tài)以及氧化應(yīng)激。然而，在iPSCs體外細(xì)胞模型中尚未發(fā)現(xiàn)斑塊和纏結(jié)，即無(wú)法呈現(xiàn)晚期的AD特征，原因可能是由于體外成熟水平神經(jīng)元需要頻繁更換培養(yǎng)基，導(dǎo)致細(xì)胞外物質(zhì)從培養(yǎng)基中清除。此外，iPSCs體外細(xì)胞模型往往是以二維表示模型，因此缺乏細(xì)胞多樣性，具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜性[35]。

2.6 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅是組成血腦屏障的重要部分，還具有分泌血管緊張素等多種血管活性物質(zhì)的功能，可對(duì)機(jī)體腦部微環(huán)境的平衡起到維持作用。AD發(fā)病特征中的Aβ沉積可引起腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷。ZHANG等[36]考察了2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L的Aβ1-42對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響，最終選擇10.0 μmol/L Aβ1-42對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，成功地建立了AD體外細(xì)胞模型。此外，LIU等[37]采用24 μmol/L的Aβ25-35對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，引起細(xì)胞凋亡，成功地建立了AD體外細(xì)胞模型，進(jìn)而證明了補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)AD的治療作用是通過(guò)RAGE/LRP1和NF-κB p65途徑實(shí)現(xiàn)的。

AD體外細(xì)胞模型的構(gòu)建與評(píng)價(jià)見表2。

表2 AD體外細(xì)胞模型的構(gòu)建與評(píng)價(jià)

3 代謝組學(xué)在AD研究中的應(yīng)用

3.1 代謝組學(xué)簡(jiǎn)介 代謝組學(xué)是通過(guò)考察生物體系(細(xì)胞、組織或生物體)受刺激或擾動(dòng)后(如某個(gè)特定的基因變異或環(huán)境變化后) 代謝產(chǎn)物圖譜及其動(dòng)態(tài)變化，研究生物體系的代謝網(wǎng)絡(luò)，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的一門新興“組學(xué)”。代謝組學(xué)常用技術(shù)包括核磁共振譜(NMR)和質(zhì)譜(MS)技術(shù)。NMR是一種廣泛應(yīng)用的技術(shù)，可以同時(shí)定性和定量檢測(cè)復(fù)雜混合物中的代謝物[38]。NMR具有一些優(yōu)勢(shì)，例如不破壞樣品、樣品制備簡(jiǎn)單、分析運(yùn)行時(shí)間較短以及能同時(shí)檢測(cè)理化性質(zhì)差異很大的代謝物。MS通常與分離技術(shù)如液相色譜(LC)或氣相色譜(GC)聯(lián)用，由于其高分辨率和質(zhì)量準(zhǔn)確度，在非靶向代謝組學(xué)方面應(yīng)用廣泛，可用于大多數(shù)代謝物的分析以及鑒定未知化合物。

代謝組學(xué)在臨床疾病研究中的應(yīng)用包括生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、疾病的診斷、治療和預(yù)后判斷等。生物標(biāo)志物是預(yù)防和診斷疾病的基礎(chǔ)，代謝組學(xué)從機(jī)體的動(dòng)態(tài)代謝途徑尋找標(biāo)志物，將基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的微小變化在代謝物上放大，檢測(cè)患者體內(nèi)所有的小分子代謝產(chǎn)物，以期發(fā)現(xiàn)與疾病診斷和治療相關(guān)的代謝標(biāo)志物[39]。

3.2 代謝組學(xué)在AD標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用 近年來(lái)，代謝組學(xué)逐漸被應(yīng)用于AD的發(fā)病機(jī)制以及藥物干預(yù)研究，研究者在不同的動(dòng)物模型中開展了AD相關(guān)代謝組學(xué)研究。周玲等[40]以UPLC-MS/MS法結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法研究了Aβ1-42誘導(dǎo)的AD小鼠模型腦組織代謝物的變化，確定了十六碳神經(jīng)鞘氨醇、二氫神經(jīng)鞘氨醇、4-羥神經(jīng)鞘氨醇、溶血磷脂酰膽堿C 20∶4、溶血磷脂酰膽堿C 18∶3、溶血磷脂酰膽堿C 16∶0、溶血磷脂酰膽堿C 13∶0、次黃嘌呤、神經(jīng)酰胺N 40∶1共9個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，并且AD小鼠模型腦組織的代謝物譜發(fā)生了明顯變化，為AD的早期診斷和治療提供了科學(xué)依據(jù)。張翠等[41]建立了UPLC-MS法，對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的AD大鼠模型尿液代謝物進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果找到8個(gè)與AD相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，其中N2-琥珀酰-L-鳥氨酸、高香草酸、異戊酰丙氨酸為首次在AD大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)，從代謝組學(xué)角度闡明AD大鼠模型體內(nèi)發(fā)生了氨基酸代謝、能量代謝和腸道菌群等代謝途徑的異常，對(duì)于AD的臨床早期診斷、預(yù)防和治療有重要意義。WANG等[42]使用甲醇、二氯甲烷和水的混合萃取溶劑進(jìn)行組織勻漿和提取，對(duì)AD轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的代謝物萃取物進(jìn)行高效的化學(xué)同位素標(biāo)記，再以高分辨液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法檢測(cè)了AD小鼠模型肝臟和腦組織的含胺或酚的代謝物的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AD轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠在肝臟和腦組織中存在顯著的代謝物差異，其中一些候選代謝物生物標(biāo)志物具有良好的辨識(shí)度。

還有一些研究者在細(xì)胞模型和人體樣本開展了AD代謝組學(xué)研究。ZHANG等[36]采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UHPLC-QTOF/MS)法，在由Aβ1-42誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分化形成的AD體外細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)了33種生物標(biāo)志物，代謝通路分析顯示AD與體內(nèi)多種氨基酸的代謝紊亂以及三羧酸循環(huán)等代謝活動(dòng)密切相關(guān)，進(jìn)而研究了丹參對(duì)AD的保護(hù)作用機(jī)制。BAHETY等[43]利用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-TOFMS)法，對(duì)經(jīng)AβPP695基因轉(zhuǎn)染倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO-AβPP695)建立的AD細(xì)胞模型進(jìn)行代謝組學(xué)分析，確定了和二十二碳六烯酸(DHA)治療效果相關(guān)的一些代謝標(biāo)志物，琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸和甘氨酸水平的升高，膽甾二烯和花生四烯酸水平的降低，提示DHA可能通過(guò)作用于三羧酸循環(huán)、膽固醇生物合成途徑和脂肪酸代謝而減輕AβPP所致的能量代謝和炎癥損傷。TAKAYAMA等[44]提出了基于數(shù)據(jù)依賴性質(zhì)譜分析的手性代謝組學(xué)方法，使用高分辨四極飛行時(shí)間質(zhì)譜分析(Q-TOF-MS)和13C-同位素編碼衍生化試劑，正確識(shí)別了D-/L-異構(gòu)體的變化，發(fā)現(xiàn)了AD患者腦脊液中40種生物標(biāo)志物，并且證明了其中有14種生物標(biāo)志物分子為手性標(biāo)志物，說(shuō)明該代謝組學(xué)方法能夠用于AD患者腦脊液中的手性和非手性標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。

4 總 結(jié)

本文對(duì)AD動(dòng)物模型、細(xì)胞模型以及代謝組學(xué)在AD研究中的應(yīng)用進(jìn)行了歸納總結(jié)。目前已知的動(dòng)物模型只能模擬AD主要的病理和神經(jīng)生化、部分行為學(xué)的改變，尚無(wú)一種AD動(dòng)物模型能夠完全模擬人類記憶喪失和癡呆的表現(xiàn)；細(xì)胞模型往往只采用單一的因素進(jìn)行誘導(dǎo)分化，與AD的病因復(fù)雜性無(wú)法保持一致；誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞近年來(lái)被眾多學(xué)者用于構(gòu)建AD的細(xì)胞模型，該細(xì)胞模型僅能用于研究家族性AD，尚不能用于藥物研發(fā)。代謝組學(xué)作為一門新型的組學(xué)，被廣泛應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)與疾病診斷和治療相關(guān)的代謝標(biāo)志物。由于AD的發(fā)病機(jī)制和病理特征都比較復(fù)雜，因此應(yīng)在未來(lái)的研究中構(gòu)建一個(gè)能夠由多個(gè)因素誘導(dǎo)的、體現(xiàn)多種病理特征的動(dòng)物模型，更好地模擬出AD的特征，建立能夠同時(shí)滿足家族性AD研究以及藥物研發(fā)的細(xì)胞模型，并將代謝組學(xué)和各種病理模型相結(jié)合，尋找與AD發(fā)病機(jī)制相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，為AD的預(yù)防、早期診斷、治療以及新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。