無溶劑微波萃取肉桂精油及成分分析

陳玨錫，張俊豐，李源棟，夏建軍

（1.湘潭大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，湖南湘潭 411105）（2.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，云南昆明 650032）

肉桂（Cinnamomum cassia Presl），又名牡桂和玉桂，屬雙子葉樟科喬木。原產(chǎn)自中國廣東、福建、云南等熱帶及亞熱帶地區(qū)，境外如印度、老撾、越南至印度尼西亞等地也廣為栽培[1]。中國對肉桂的藥用價值的探究，可以追溯到秦朝之前，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，肉桂主上氣咳逆，結(jié)氣喉痹吐吸，利關(guān)節(jié)，補(bǔ)中益氣。肉桂富含豐富的揮發(fā)油，張笮晦等的研究表明肉桂中揮發(fā)油的含量達(dá)到 1.75%~6.41%[2]。肉桂精油為黃色或紅棕色油狀液體，其含有桂皮醛、醋酸桂皮酯、苯甲醛和桂皮酸等[3,4]天然成分，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品及香料領(lǐng)域。

目前肉桂精油的提取主要采用水蒸氣蒸餾法（Steam distillation，SD）[5]，超臨界 CO2萃取技術(shù)（Supercritical CO2extraction，SFE-CO2）[6]，超聲波輔助水蒸氣蒸餾法（Ultrasonic assisted hydrodistillation，UAHD）[7]。但這些方法面臨著提取效率不高、操作復(fù)雜、有機(jī)溶劑殘留及能耗大等問題，并且提取過程中可能會造成部分揮發(fā)性化合物的損失。本著“綠色化學(xué)”的理念，本研究采用無溶劑微波萃取工藝（Solvent-free Microwave Extraction，SFME），該方法利用微波輻射使植物細(xì)胞中的分子鍵位產(chǎn)生熱效應(yīng)，促使細(xì)胞膜和細(xì)胞壁破裂，讓細(xì)胞組織內(nèi)的精油充分釋放出來[8]。與傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法相比，無溶劑微波萃取工藝提取效率更高、不需要添加任何溶劑、并能獲得更高品質(zhì)的植物揮發(fā)油以及更加清潔和環(huán)保。

目前還未有關(guān)于無溶劑微波萃取工藝提取肉桂精油的相關(guān)報道，因此本研究對無溶劑微波萃取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化；采用氣相色譜-質(zhì)譜（Gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）對精油進(jìn)行成分鑒定；并利用掃描電子顯微鏡 SEM 觀察萃取后的肉桂微觀形貌；此外，將精油成分、抗氧化性能力和肉桂表面形貌特征與水蒸氣蒸餾法相對比，以期為肉桂的開發(fā)及利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 原料

藥材購于云南省官渡區(qū)菊花村中藥材批發(fā)市場，產(chǎn)地云南，經(jīng)鑒定為樟科植物肉桂的干燥樹皮，粉碎過40目篩。

1.2 儀器與試劑

試劑：二氯甲烷、甲醇、正己烷、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、無水乙醇、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、雙氧水、磷酸二氫鈉，GR級，百靈威科技有限公司；L-抗壞血酸（Vc）、正構(gòu)烷烴 C7-C30，美國Sigma-Aidrich公司。

儀器：WLD07S-05型微波設(shè)備，南京三樂微波技術(shù)發(fā)展有限公司；超高速多功能粉碎機(jī)，SZ-500A-3永康市善竹貿(mào)易有限公司；Agilent7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀+自動進(jìn)樣器，美國安捷倫科技有限公司；萬分之一電子天平，瑞士Mettler Tloede公司；10 mL移液器，德國Eppendorf公司；JSM-6610LV掃描電子顯微鏡，日本JEOL公司。

1.3 肉桂揮發(fā)油提取方法

1.3.1 無溶劑微波萃取工藝

將100.00 g桂皮原料（40 目），通過間歇式噴霧加水配置成一定含水量的樣品，裝入500 mL蒸餾燒瓶中，將樣品浸潤一定時間后放入微波萃取裝置內(nèi)，調(diào)節(jié)微波功率和提取時間。觀察揮發(fā)油收集器中揮發(fā)油含量，將提取的精油于4 ℃下保藏，待測[9]。

1.3.2 水蒸氣蒸餾法

將100.00 g桂皮原料（40目），裝入500 mL蒸餾燒瓶中，按常規(guī)水蒸氣蒸餾法進(jìn)行連續(xù)萃取，直到揮發(fā)油收集器中揮發(fā)油含量不再增加為止（耗時6 h），測得揮發(fā)油測定器內(nèi)的精油量，于4 ℃下保藏，待測。

1.4 GC/MS分析條件

色譜條件：RXi-5sil MS石英毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣（純度為99.99%），流速：1.00 mL/min。升溫程序：初始溫度60 ℃，保持6 min；以3 ℃/min的速率升溫至180 ℃；再以10 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持10 min。進(jìn)樣口溫度：250 ℃，進(jìn)樣量：1.0 μL，分流比：10:1，溶劑延遲6 min。

質(zhì)譜條件：電轟擊電離（EI）源；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：280 ℃；掃描范圍：40m/z~450m/z，質(zhì)譜檢索圖庫：Nist11譜庫。

1.5 掃描電子顯微鏡SEM

使用JSM-6610LV掃描電子顯微鏡表征不同提取方法的樣品表觀形貌變化。將無溶劑微波處理肉桂樣品、水蒸氣蒸餾處理肉桂樣品和空白樣品干燥后，用導(dǎo)電膠固定在臺面上，然后將樣品噴金 100 s；并在高真空和10.0 kV電壓的條件下進(jìn)行測試。

1.6 抗氧化活性的測定方法

1.6.1 DPPH自由基的清除

參考王園等的方法[10]，準(zhǔn)確稱取2.0 mL不同濃度樣品溶液于試管中，加入0.2 mmol/L的DPPH溶液2.0 mL，震蕩均勻后，置于陰暗處20 min，在517 nm波長處測定吸光度，測到樣品溶液和DPPH溶液的吸光度Asample；準(zhǔn)確稱取2.0 mL樣品溶液于試管中，加入蒸餾水2.0 mL，震蕩均勻后，于陰暗處放置20 min，在517 nm，測得空白樣品吸光度Ablank；再準(zhǔn)確取2.0 mL的DPPH溶液于試管中，加入蒸餾水2.0 mL，震蕩均勻后，置于陰暗處20 min，在517 nm處測定吸光度，測得DPPH溶液吸光度ADPPH；各重復(fù)3次試驗，后求平均值，DPPH自由基清除率計算公式如下：

1.6.2 羥基自由基的清除

參考紀(jì)俊敏等的方法[11]，向10 mL試管中準(zhǔn)確加入7.5 mmoL/L的鄰二氮菲溶液1.0 mL，2 mol/L的PH7.4磷酸鹽緩沖溶液2 mL和樣品溶液1.0 mL，充分震蕩后，加入7.5 mmol/L硫酸亞鐵溶液1.0 mL，再次混勻后加入1.0 mL 0.1% H2O2，置于38 ℃恒溫水浴中60 min后，于波長536 nm處測吸光度，記作AS；以去離子水代替樣品作為空白實驗進(jìn)行對比，測得的吸光度記作Ab；以去離子水替代H2O2作為損傷組，測得的吸光度記作An，OH自由基清除率計算公式如下：

OH自由基清除率/%=[(AS-An)/(Ab-An)]×100%

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Minitab 19軟件進(jìn)行正交試驗設(shè)計及無溶劑微波工藝條件優(yōu)化；肉桂油化學(xué)成分鑒定采用 Nist 11譜庫進(jìn)行檢索后，結(jié)合ESO香精保留指數(shù)進(jìn)行對比和定性，利用面積歸一化計算各成分相對百分含量；采用SPSS 22和origin 8.0對試驗數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和可視化分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 SFME各因素對精油得率的影響

2.1.1 提取時間對精油得率的影響

從圖1可以看出，提取時間在30~50 min時，肉桂精油提取率有較大增幅，50~60 min肉桂精油提取率的增速減緩，60 min以后肉桂精油提取率基本不再增加。因為微波處理時間過短，肉桂的細(xì)胞壁及胞內(nèi)熱效應(yīng)程度低，細(xì)胞不能完全破裂，精油不能充分溶出，隨著提取時間的延長，植物細(xì)胞破碎程度增高，精油提取率也相應(yīng)增加[12]。

圖1 提取時間對精油得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the yield of essential oils

2.1.2 微波功率對精油得率的影響

由圖2可知，在微波功率調(diào)至300 W~400 W時，肉桂精油提取率增長迅速，當(dāng)微波功率達(dá)到 400 W~450 W，肉桂精油提取率呈現(xiàn)一個峰值，微波功率在450 W以后，肉桂精油呈下降趨勢。因為微波功率會影響整個系統(tǒng)的升溫速度和溶劑分子的震蕩頻率，當(dāng)微波功率過小時，系統(tǒng)升溫速度慢，植物細(xì)胞破碎程度低，而微波輻射功率過高時，會降解揮發(fā)出的化合物以及植物材料[13,14]。在微波功率500 W下萃取60 min，植物樣品出現(xiàn)了碳化現(xiàn)象。

圖2 微波功率對精油得率的影響Fig.2 Effect of microwave power on the yield of essential oils

2.1.3 含水率對精油得率的影響

從圖3可以看出，隨著含水率的增加，精油得率也呈先上升后下降趨勢。含水率在 60%~70%之間使肉桂精油得率達(dá)到峰值。而含水率超過70%，肉桂精油得率逐漸降低。其原因主要是，含水率適當(dāng)時，分子擴(kuò)散有利于肉桂精油的提取[15]。過高的含水率使水分子對微波有強(qiáng)的吸附作用，降低達(dá)到細(xì)胞內(nèi)部的輻射，從而使肉桂油得率下降。

圖3 含水率對精油得率的影響Fig.3 Effect of moisture content on the yield of essential oils

2.1.4 浸潤時間

由圖4可知，肉桂精油得率隨著浸泡時間的增加而上升。肉桂精油存在于細(xì)胞組織中，用水浸潤過后能加速植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的膨脹和分裂，從而提高針葉精油肉桂精油的提取率。當(dāng)提取時間達(dá)到2 h時，肉桂精油提取率的增長速率放緩，在2.5 h以后趨于穩(wěn)定。適當(dāng)?shù)暮视欣谌夤鹁偷娜艹?，但是?dāng)浸潤時間在2~3 h的時候，肉桂粉末對水的吸收已經(jīng)達(dá)到了飽和，延長浸潤時間無助于提高肉桂精油的提取率[16]。

圖4 浸潤時間對精油得率的影響Fig.4 The effect of soaking time on the yield of essential oils

2.2 正交試驗優(yōu)化無溶劑微波萃取工藝條件

在上述單因素試驗結(jié)果中，以肉桂精油得率為評價指標(biāo)。選擇提取時間（50 min、60 min、70 min）、微波功率（400 W、450 W、500 W）、含水率（50%、60%、70%）、浸潤時間（1.5 h、2 h、2.5 h）進(jìn)行四因素三水平正交試驗，從而優(yōu)化無溶劑微波萃取工藝條件。正交試驗因素設(shè)計表如表1所示，試驗設(shè)計結(jié)果如表2所示。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Horizontal table of orthogonal test factors

表2 試驗結(jié)果與分析Table 2 Orthogonal test design and results

從表2可以看出，4個重要因素指標(biāo)對試驗影響大小的排序為：提取時間>微波功率>含水率>浸潤時間，無溶劑微波萃取工藝提取肉桂油的最佳試驗條件為提取時間60 min、微波功率450 W、含水率60%、浸潤時間2.5 h。在此條件下，進(jìn)行5次平行試驗后精油得率平均值為3.15%，優(yōu)于工藝優(yōu)化前的得率，較水蒸氣蒸餾法提高了 35.78%，因此最優(yōu)工藝條件為A2B2C2D3。無溶劑微波萃取工藝四因素三水平正交試驗結(jié)果與顯著性分析見表3，因為浸潤時間對肉桂油得率影響最小，故將D浸潤時間作為誤差項，對其他因素進(jìn)行顯著性分析，得出提取時間A對肉桂油得率具有顯著影響(p<0.05)。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal test results

2.3 肉桂油GC/MS分析

肉桂油中化學(xué)成分經(jīng) GC/MS檢測所得到總離子流色譜圖如圖5所示，其結(jié)果采用Nist11譜庫進(jìn)行檢索后結(jié)合 ESO香精保留指數(shù)進(jìn)行對比對其定性[17]，利用面積歸一化計算得出桂皮油中各成分相對百分含量，結(jié)果見表4。

圖5 肉桂油(SFME)氣相色譜/質(zhì)譜總離子流色譜圖Fig.5 Gas chromatographic/mass spectrometry total ion chromatogram of cinnamon oil extracted by SFME method

表4 GC/MS方法對肉桂油揮發(fā)性成分的定性結(jié)果Table 4 Composition analysis of cinnamon oil

圖6 肉桂油(SD)氣相色譜/質(zhì)譜總離子流色譜圖Fig.6 Gas chromatography/mass spectrometry total ion chromatogram of cinnamon oil extracted by SD method

圖7 無溶劑微波和水蒸氣蒸餾肉桂油中主要化合物的百分比含量Fig.7 Percentage content of the main compounds of cinnamon essential oil extracted by SFME and HD

通過質(zhì)譜庫檢索和人工圖譜解析，并結(jié)合保留指數(shù)比對，在無溶劑微波萃取肉桂油中主要鑒定出 24種化合物，占揮發(fā)性成分91.63%，烯烴類10種，酯類3種，醇類4種，醛類4種，其它化合物3種，按含量數(shù)值從大到小依次為：(E)-肉桂醛（67.69%）、丁香酚（11.36%）、芳樟醇（4.26%）、檸檬烯（2.40%）等化合物；水蒸氣蒸餾萃取肉桂油中主要鑒定出 25種化合物，占揮發(fā)性成分88.94%，烯烴類11種，酯類4種，醇類3種，醛類4種，其它化合物4種，按含量數(shù)值從大到小依次為：(E)-肉桂醛（59.12%）、丁香酚（14.13%）、芳樟醇（5.39%）、檸檬烯（1.78%）等化合物。無溶劑微波萃取工藝不需要溶劑，產(chǎn)生的水解效應(yīng)更低，因此能得到高比例的含氧化合物[18]。

無溶劑微波萃取與水蒸氣蒸餾萃取肉桂油的共有成分 20種，主要為萜烯類。而無溶劑微波萃取肉桂油中增添了(Z)-氧化芳樟醇5(呋喃型)、苯丙醛、香葉醇、δ-杜松烯，未檢測出α-水芹烯、乙酸芐酯、胡椒酚、α-甲基(E)-肉桂醛、α-蛇麻烯。相較于水蒸氣蒸餾萃取肉桂油，無溶劑微波萃取肉桂油中抗腫瘤活性成分(E)-肉桂醛含量提升了14.49%，肉桂醛是肉桂油的主要成分，肉桂醛的含量直接影響肉桂油的品質(zhì)，肉桂醛廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品和保健領(lǐng)域[19,20]，具有殺菌防腐、促進(jìn)血液循環(huán)和抗腫瘤的效果[21,22]。此外，無溶劑微波萃取肉桂油中檸檬烯的含量較水蒸氣蒸餾萃取肉桂油提高了34.51%，檸檬烯能有效抑制致腐微生物的生長，而且對人體無毒害作用，具有良好的藥用潛在價值[23,24]。

2.4 SEM形貌特征

為了進(jìn)一步闡明無溶劑微波萃取肉桂油的機(jī)理，采用掃描電子顯微鏡SEM觀察未經(jīng)處理的肉桂樣本、水蒸氣蒸餾后的肉桂樣本和無溶劑微波萃取后的肉桂樣本。如圖8a所示，未經(jīng)任何處理的樣品的外部結(jié)構(gòu)光滑且較為完整，沒有觀察到明顯的破壞。經(jīng)水蒸氣蒸餾提取后（圖8b），樣品表面出現(xiàn)了一定程度的破裂。而經(jīng)無溶劑微波萃取后（圖8c和圖8d），樣品表面可以觀察到明顯的空隙，并且具有許多不規(guī)則的空腔結(jié)構(gòu)。水蒸氣蒸餾工藝的傳熱主要是通過傳導(dǎo)和對流實現(xiàn)的；相比之下，無溶劑微波萃取過程中，細(xì)胞內(nèi)部的熱量積累超過了其傳輸能力，而導(dǎo)致細(xì)胞破裂得更快及更徹底[25]。顯然，與水蒸氣蒸餾提取工藝相比，無溶劑微波萃取工藝能獲得更高的精油得率。

圖8 肉桂表面的SEM形貌特征Fig.8 SEM images of cinnamon

2.5 抗氧化活性測定

2.5.1 DPPH自由基清除率

對DPPH的清除率，如圖9所示。隨著質(zhì)量濃度的不斷增加，無溶劑微波萃取肉桂油和水蒸氣蒸餾肉桂油和對DPPH自由基的清除率皆呈先增高后趨于穩(wěn)定的趨勢；當(dāng)質(zhì)量濃度提升至5 mg/mL時，兩種方法提取的肉桂油對DPPH自由基的清除率皆達(dá)到80%以上，且無溶劑微波萃取肉桂油的DPPH·清除率優(yōu)于水蒸氣蒸餾肉桂油；對兩者的IC50進(jìn)行計算，分別為2.10 mg/mL（無溶劑微波萃取肉桂油）、2.37 mg/mL（水蒸氣蒸餾萃取肉桂油）。

圖9 不同方法萃取肉桂油對DPPH自由基的清除作用Fig.9 Scavenging activity of cinnamon oil extracted by different methods on DPPH free radical

2.5.2 羥基自由基清除率

由圖10可知，無溶劑微波萃取肉桂油和水蒸氣蒸餾肉桂油在0.1~0.8 mg/mL范圍內(nèi)，對羥基自由基的清除率隨精油濃度的升高而趨于平緩，在 0.8 mg/mL的濃度時，兩者的清除率分別為 90.57%和86.27%；無溶劑微波萃取肉桂油和水蒸氣蒸餾萃取肉桂油和的羥基自由基清除能力的IC50進(jìn)行計算，結(jié)果分別為0.17 mg/mL（無溶劑微波萃取肉桂油）、0.22 mg/mL（水蒸氣蒸餾萃取肉桂油），表明無溶劑微波萃取肉桂油的羥基自由基清除效果明顯強(qiáng)于水蒸氣蒸餾萃取肉桂油。

圖10 不同方法萃取肉桂油對羥基自由基的清除作用Fig.10 Scavenging activity of cinnamon oil extracted by different methods on hydroxyl radicals

3 結(jié)論

3.1 采用無溶劑微波萃取工藝對肉桂油進(jìn)行萃取，并利用正交試驗進(jìn)行工藝優(yōu)化，得到最佳試驗條件：提取時間60 min、微波功率450 W、含水率60%、浸潤時間2.5 h。萃取的肉桂精油為橙黃色油狀液體，具有濃郁香味，精油得率為3.15%，較傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法提高了 35.78%。利用氣象色譜/質(zhì)譜法對肉桂精油成分進(jìn)行分析，從無溶劑微波萃取肉桂油中鑒定出24種物質(zhì)，占揮發(fā)性成分 91.63%，主要成分為烯類 10種、酯類3種、醇類4種、醛類4種及其它化合物3種，按含量數(shù)值從大到小依次為：(E)-肉桂醛（67.69%）、丁香酚（11.36%）、芳樟醇（4.26%）、檸檬烯（2.40%）等。無溶劑微波萃取肉桂油中的肉桂醛及檸檬烯含量較水蒸氣蒸餾萃取肉桂油分別提高了14.49%和34.51%，表明無溶劑微波萃取肉桂油有更強(qiáng)的藥理活性。掃描電子顯微鏡 SEM 觀察到無溶劑微波萃取后的肉桂樣品有明顯的空隙和大量不規(guī)則的空腔結(jié)構(gòu)，更有利于肉桂油的產(chǎn)出。無溶劑微波萃取肉桂油對DPPH·和羥基自由基清除作用的IC50分別為2.10 mg/mL和2.37 mg/mL，均優(yōu)于傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法萃取肉桂油的0.17 mg/mL和0.22 mg/mL。

3.2 無溶劑微波萃取工藝是一種高效、清潔、無污染和無殘留的提取技術(shù)，可作為傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法提取肉桂油的替代工藝。與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法相比，無溶劑微波萃取工藝有效避免了溶劑的消耗和可能產(chǎn)生的環(huán)境污染，同時降低了肉桂油成分中含氧化合物的水解并有效提高了肉桂油得率。本研究為進(jìn)一步開發(fā)以肉桂為原料的天然香料和植物精油防腐劑等提供了數(shù)據(jù)支撐。