痤瘡湯治療痤瘡的機(jī)制及對(duì)p38MAPK信號(hào)通路的影響

王燕 劉明珠

(1江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，江蘇 鹽城 224005；2南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院皮膚科)

痤瘡是一種面部毛囊皮脂腺的炎癥性疾病，發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能是由于皮脂分泌過多，痤瘡丙酸桿菌增殖及雄激素睪酮增高等因素導(dǎo)致皮脂分泌增高、毛囊上皮角化異常及上皮細(xì)胞難以正常排出而蓄積于毛囊口，成為粉刺，嚴(yán)重者可增加患者的心理負(fù)擔(dān)，影響生活和學(xué)習(xí)〔1,2〕。一般病程長(zhǎng)，給予西藥治療，效果明顯，但不良反應(yīng)較大，且容易復(fù)發(fā)，面部容易殘留瘢痕及沉淀色素〔3,4〕。中醫(yī)在治療痤瘡方面具有一定優(yōu)勢(shì)，本研究根據(jù)中醫(yī)文獻(xiàn)及臨床經(jīng)驗(yàn)，研發(fā)了痤瘡湯，治療痤瘡療效確切且安全性高，但該方的機(jī)制探討較少。p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路屬于應(yīng)激激活的蛋白激酶信號(hào)通路，是細(xì)胞外的生理及病理信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵通路，研究顯示p38MAPK信號(hào)通路也參與了痤瘡的發(fā)生發(fā)展過程〔5〕。本研究主要分析痤瘡湯治療痤瘡的可能機(jī)制，為痤瘡湯的臨床研究提供參考。

1 資料和方法

1.1受試動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2002-0010。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。痤瘡丙酸桿菌(ATCC-6919，上海北諾生物科技有限公司，厭氧 4℃保存)。

1.2藥品、試劑及儀器 痤瘡湯的配方：黃芩、桑白皮、連翹和蒲公英各15 g，生地黃、玄參、白茅根、牡丹皮、丹參、郁金和枳殼各10 g，枇杷葉5 g，煎煮兩次，合并煎液并濃縮至10 g/ml；BS224S萬分之一電子天平(德國(guó)SARTORIUS)；蘇木素-伊紅(HE)全套病理系統(tǒng)(德國(guó)萊卡公司)；OlympusDP2-BSW型病理圖像采集系統(tǒng)(日本奧林巴斯公司)；Bio-RAD680酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂公司)。

1.3痤瘡大鼠模型制備 取痤瘡丙酸桿菌菌株1株，于血培養(yǎng)基接種，置于厭氧培養(yǎng)罐，37℃培養(yǎng)48 h，活化后可見灰白色，針尖樣，表面光滑，行革蘭染色可見短小棒狀的桿菌，用生理鹽水調(diào)整細(xì)菌濃度為 3×108/ml。吸取痤瘡丙酸桿菌混懸液50 μl，在大鼠左側(cè)耳廓皮下注射。

1.4分組與給藥 將痤瘡大鼠分為3組，即模型組，痤瘡湯低劑量組(5 g/kg)和痤瘡湯高劑量組(10 g/kg)；另設(shè)對(duì)照組將1.3中痤瘡丙酸桿菌混懸液替換為生理鹽水同法處理。每組各16只，雌雄各半。模型組和對(duì)照組均給予10 g/kg生理鹽水，各組均連續(xù)治療10 d。

1.5指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1耳廓外觀及病理觀察 分別于給藥前及給藥10 d后測(cè)定各組耳廊厚度。給藥結(jié)束，處死大鼠，制備耳廓病理切片，鏡下觀察并計(jì)數(shù)其炎癥細(xì)胞。

1.5.2耳廓厚度記錄 以千分尺測(cè)量大鼠給藥前后的左耳廓同一部位的厚度。

1.5.3p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè)治療前后從大鼠眼眶靜脈叢取血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中p38MAPK通路相關(guān)蛋白絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MEK)1、MEK2、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1和ERK2水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNQ-q檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組耳廓外觀、厚度、HE病理及炎癥細(xì)胞數(shù)量的比較 對(duì)照組大鼠左側(cè)耳廓皮膚粉紅，肌理細(xì)膩，無明顯變化；模型組左側(cè)耳廓注射部位持續(xù)紅腫，局部形成小丘疹，少數(shù)質(zhì)硬；痤瘡湯低、高劑量組左側(cè)耳廓有腫脹，耳廓略有增厚，丘疹少見。對(duì)照組左側(cè)HE病理切片顯示表皮、真皮和皮下組織結(jié)構(gòu)清晰完整，無明顯的炎癥介質(zhì)浸潤(rùn)。模型組皮下組織結(jié)構(gòu)消失，炎癥細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)，部分形成膿腫，毛囊面積增大或擴(kuò)張，皮脂腺消失；痤瘡湯低、高劑量組可見毛囊皮脂腺縮小，存在少數(shù)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與對(duì)照組比，模型組耳廓皮膚的炎癥細(xì)胞及耳廓厚度明顯增高(P<0.05)，與模型組比，痤瘡湯低、高劑量組的炎癥細(xì)胞及耳廓厚度明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性關(guān)系；痤瘡湯低、高劑量組治療后耳廊厚度顯著低于治療前(P<0.05)。見表1和圖1。

圖1 各組耳廓HE病理(×100)

表1 各組耳廓炎癥細(xì)胞及耳廓厚度比較

2.2各組p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的比較 治療前，與對(duì)照組比，模型組和痤瘡湯低、高劑量組MEK1、MEK2、ERK1和ERK2均明顯增高(P<0.05)；治療后，與對(duì)照組比較，模型組MEK1、MEK2、ERK1和ERK2顯著較高(P<0.05)；與模型組比較，痤瘡湯組低、高劑量MEK1、MEK2、ERK1和ERK2明顯降低，且顯著低于治療前(P<0.05)，且呈劑量依賴性關(guān)系。見表2。

表2 各組外周血p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的比較

3 討 論

中醫(yī)典籍里沒有“痤瘡”的病名，但痤瘡的癥狀在中醫(yī)屬于“粉刺”、“面鼓”和“酒刺”的范疇，中醫(yī)認(rèn)為痤瘡由于脾虛不運(yùn)，水濕內(nèi)停，耗損氣血津液，郁久化熱，無力抗邪，濕熱灼痰凝滯肌膚而成，治療當(dāng)以除濕化痰、清熱解毒及行氣活血〔6～10〕。痤瘡湯中黃芩、桑白皮、連翹和枇杷葉可清肺熱，連翹與蒲公英可清胃熱，生地黃、玄參和白茅根可清熱涼血，牡丹皮與丹參涼血活血，郁金和枳殼疏肝理氣活血，全方共奏清熱解毒和除濕化痰之效。本研究結(jié)果顯示，向痤瘡大鼠給予痤瘡湯，左耳廓的外觀明顯改善，微觀病理顯示痤瘡湯可縮小毛囊皮脂腺，降低炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且臨床癥狀及病理改善程度呈明顯的劑量依賴性關(guān)系，提示痤瘡湯可用于治療痤瘡。

p38MAPK信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及分裂的信號(hào)核心部分，通過調(diào)控炎癥的方式參與多種皮膚系統(tǒng)疾病的病理學(xué)過程，許多皮膚病變中p38MAPK信號(hào)通路處于過度激活的狀態(tài)〔11～14〕，如調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路可改善基質(zhì)金屬蛋白酶水平異常，進(jìn)而治療光老化人皮膚相關(guān)的細(xì)胞損傷，p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活是扁平苔蘚發(fā)病的重要病因，p38MAPK參與光動(dòng)力療法殺傷皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的病理過程，p38MAPK納入皮膚鱗狀細(xì)胞癌潛在靶點(diǎn)的研究，p38絲裂原激活蛋白激酶通路可降低紫外線輻射后皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡及炎性損傷，燒傷皮膚再生醫(yī)療通過調(diào)控p38信號(hào)通路治療糖尿病足，MEK1、MEK2、ERK1和ERK2是p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)的蛋白，ERK是MAPK家族的重要成員，ERK是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，已知的ERK家族有5個(gè)亞族，其中研究較為透徹的是ERK1和EKR2，MEK(MEK1與MEK2)位于ERK上游，可特異性抑制MEK的磷酸化阻斷其下游ERK活化。研究顯示，與治療前比，紫外線輻射皮膚患者及糖尿病足患者治療后外周血的MEK1、MEK2、ERK1和ERK2顯著降低，提示p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活的重要標(biāo)志是MEK1、MEK2、ERK1和ERK2蛋白表達(dá)上調(diào)〔15〕，本課題結(jié)果提示痤瘡可能激活了p38MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)了痤瘡的發(fā)生發(fā)展，痤瘡湯有助于調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路，可用于治療痤瘡。

痤瘡湯調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路可能與該湯劑所含的有效成分相關(guān)。報(bào)道顯示黃芩所含的黃芩素能夠抑制c6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞MEK-1蛋白的磷酸化表達(dá)，提示黃芩以MEK-1蛋白為靶點(diǎn)作用于炎癥通路，不同濃度的黃芩素均能夠抑制癌癥細(xì)胞中 ERK1/2 的磷酸化上調(diào)〔16～18〕。含有桑白皮的清金化痰湯可通過抑制肺組織P38/c-Jun氨基末端激酶(JNK)MAPK信號(hào)通路的過度活化而減輕大鼠急性氣道炎癥損傷〔19〕。蒲公英所含的三萜類物質(zhì)可抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7細(xì)胞p38和ERK1/2激酶的磷酸化，且呈劑量依賴關(guān)系而發(fā)揮抗炎作用〔20〕。

綜上所述，痤瘡湯治療痤瘡的可能機(jī)制在于影響p38MAPK信號(hào)通路。