miR-221在急性心肌梗死大鼠心肌損傷中的作用及機(jī)制

郝星 龍仙萍 王正龍

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

急性心肌梗死(AMI)是一種因心肌極度缺血導(dǎo)致的急性血栓類疾病，以致最終發(fā)生血管閉塞的心血管疾病。AMI常發(fā)于老年人，發(fā)病率及致殘率高，嚴(yán)重威脅患者的健康〔1，2〕。目前AMI發(fā)病機(jī)制尚未闡明，但心肌細(xì)胞凋亡是AMI早期的重要原因之一，是引起心肌重構(gòu)及心力衰竭的重要因素之一。因此，抑制心肌細(xì)胞凋亡對于AMI的抑制非常重要〔3〕。miRNA作為內(nèi)生性、序列結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上高度保守的長度約為18～23 nt的一類非編碼RNA分子，通過靶向結(jié)合于下游靶基因，通過調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和降解，對細(xì)胞的增殖與凋亡、細(xì)胞的生長與分化等生物學(xué)行為進(jìn)行參與。研究表明miRNA能特異性表達(dá)于心肌細(xì)胞中，且miRNA在AMI、心肌肥大、心律失常、心力衰竭等多種心血管疾病中異常表達(dá)〔4，5〕，其中發(fā)現(xiàn)miR-221在AMI患者心肌組織有較高的表達(dá)，但其機(jī)制尚未可知〔6～8〕。本研究旨在探討miR-211在AMI大鼠心肌損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 實驗對象：選擇55只雄性SD大鼠體重(200±20)g，在(23±2)℃室內(nèi)模擬晝夜環(huán)境飼養(yǎng)，可自由飲食和飲水。試劑及儀器:兔抗人Bax、Bcl-2、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、Ki67、細(xì)胞外蛋白調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、p-ERK1/2、GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、BCA試劑盒、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、Caspase-9活性檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol 試劑盒，RT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自美國Invitrogen；miR-221抑制劑、miR-221 NC、雙垂直電泳儀及配套凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司；多功能酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司。

1.2方法

1.2.1AMI建模與給藥〔3〕選取43只大鼠建AMI模型，操作過程如下：利用10%水合氯醛將大鼠進(jìn)行麻醉，將大鼠的頸部和胸部毛發(fā)進(jìn)行徹底消毒并剃除，切開皮膚，做1 cm直徑切口，連接呼吸機(jī)設(shè)置并調(diào)整呼吸頻率、潮氣量、呼吸時間參數(shù)。接著以大鼠胸部左側(cè)的第4根肋骨為手術(shù)切口，將大鼠皮膚逐層剝離，暴露出心臟，結(jié)扎冠狀動脈左前降支，心電圖出現(xiàn)ST段抬高，為AMI建模成功。40只大鼠成功建立AMI模型。隨機(jī)選取建模成功的36只大鼠作為本次研究的對象，均分為AMI組、對照組及抑制組，同時選取正常大鼠12只，按照建模大鼠操作，只對冠狀動脈穿線不結(jié)扎，作為假手術(shù)組。選取12只大鼠轉(zhuǎn)染慢病毒空載體miR-221-NC作為對照組；選擇12只攜帶miR-221抑制劑慢病毒作為抑制組；AMI組和假手術(shù)組隔日1次給予生理鹽水，連續(xù)2 w。

1.2.2檢測大鼠心臟功能 經(jīng)過2 w的治療后，麻醉大鼠，彩超檢查心臟下述指標(biāo)：左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)和左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)及左室長軸縮短分?jǐn)?shù)(FS)。

1.2.3Tunel法檢測心肌凋亡指數(shù)(AI) 取心肌組織，石蠟包埋，切片，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、通透、PBS洗滌、反應(yīng)液孵育、PBS洗滌、染色封片，顯微鏡下觀察計算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞棕黃色者為凋亡細(xì)胞。

1.2.4miR-221表達(dá)檢測 提取心肌組織中RNA，確保純度滿足測試后，行RNA逆轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后行 PCR擴(kuò)增，設(shè)計引物參照文獻(xiàn)。35次循環(huán)。

1.2.5Caspase-3及Caspase-9活性檢測 取適量大鼠心肌組織，勻漿并離心，加入胰蛋白酶裂解，離心獲得上清液，按照Caspase-3及Caspase-9活性檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.2.6Western印跡 Western印跡檢測Bax，Bcl-2，PCNA，livin，p-ERK1/2蛋白表達(dá)。處死大鼠后取心肌組織研磨成漿，離心后加入細(xì)胞裂解液，裂解30 min，取上清液檢測蛋白濃度。將蛋白樣品煮沸變性10 min后，上樣、電泳和轉(zhuǎn)膜后，將2%BSA封閉1 h，然后一抗溶液(兔抗Bax，Bcl-2，PCNA，Ki67，p-ERK1/2，GAPDH單克隆抗體，稀釋度為1∶100)于4℃孵育。第2天加二抗溶液，稀釋度為1∶200，室溫孵育1 h，滴入化學(xué)曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-221在AMI大鼠心肌中的表達(dá) 與假手術(shù)組miR-211表達(dá)量(0.84±0.08)相比，AMI組(3.28±0.30)顯著提高(P<0.01)。

2.2miR-221 inhibitor在AMI大鼠心肌中miR-221表達(dá)量的作用 與假手術(shù)組miR-211表達(dá)量(0.88±0.08)相比，AMI組(3.22±0.30)及對照組(3.20±0.30)均顯著提高(P<0.01)；與AMI組及對照組相比，抑制組(1.35±0.13)顯著降低(P<0.01)。

2.3miR-221對AMI大鼠心臟功能的影響 與假手術(shù)組和抑制組比較，AMI組及對照組LVEF、FS水平均顯著降低，而LVEDD及LVESD水平均顯著升高(P<0.01)。見表1。

2.4miR-221抑制劑對AMI大鼠心肌AI的作用 與假手術(shù)組心肌AI(2.48±0.20)相比，AMI組(36.71±3.64)及對照組(36.29±3.62)均顯著提高(P<0.01)；與AMI組及對照組相比，抑制組(7.43±0.69)顯著降低(P<0.01)。

2.5miR-221抑制劑對AMI大鼠心肌組織中Caspase-3及Caspase-9活性影響 與假手術(shù)組相比，AMI組及對照組中心肌組織中Caspase-3及Caspase-9活性明顯升高(P<0.01)；與AMI組及對照組相比，抑制組中心肌組織中Caspase-3及Caspase-9活性顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 miR-221對AMI大鼠心臟功能的影響及miR-221抑制劑對心肌組織中Caspase-3及Caspase-9的作用

2.6miR-221抑制劑對AMI大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2、PCNA及Ki67蛋白表達(dá)量的影響 與假手術(shù)組比較，AMI組及對照組中Bcl-2、PCNA及Ki67表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.01)，Bax表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.01)；與AMI組及對照組比較，抑制組中Bcl-2、PCNA及Ki67表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.01)，Bax表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.01)。見圖1，表2。

表2 miR-221抑制劑對AMI大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2、PCNA及Ki67表達(dá)量的影響

2.7miR-221 inhibitor對AMI大鼠心肌組織中p-ERK1/2表達(dá)量的影響 與假手術(shù)組p-ERK1/2表達(dá)量(1.88±0.16)比較，AMI組(0.85±0.08)及對照組(0.84±0.08)明顯下調(diào)(P<0.01)；與AMI組及對照組比較，抑制組(1.63±0.15)明顯上調(diào)(P<0.01)。見圖2。

1～4：假手術(shù)組、AMI組、對照組、抑制組；下圖同圖1 miR-221抑制劑對AMI大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2、PCNA及Ki67蛋白表達(dá)量的影響

圖2 miR-221抑制劑對AMI大鼠心肌組織中p-ERK1/2表達(dá)量的影響

3 討 論

近年研究證實miRNA在AMI、心律失常、心力衰竭等心血管疾病中異常表達(dá)，包括miR-221〔4,9〕。miR-221與miR-222是同源miRNA，最初是從斑馬魚中克隆并得到證實，后來又在HL-60白血病細(xì)胞得到確證。miR-221定位于人類X染色體的p11.3區(qū)，在眾多腫瘤組織中高表達(dá)，因此被認(rèn)為是一種有癌基因的miRNA〔10〕。Souza等〔6〕對心力衰竭大鼠心肌測量miR-221顯示為高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)AMI患者miRNA表達(dá)異常，以miR-221表達(dá)為主，為健康人的3.89倍。同時還證實miR-221有心肌保護(hù)作用，能抑制缺血再灌注引起的心肌損傷〔8〕。

AMI過程中會產(chǎn)生大量的活性氧，使得心肌細(xì)胞凋亡，心肌損傷，甚至可能引起心力衰竭與心室重構(gòu)。故控制AMI心肌細(xì)胞凋亡，對AMI的發(fā)展有遏制作用〔11，12〕。本研究結(jié)果表明miR-221 inhibitor可有效抑制AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡受凋亡蛋白調(diào)控，例如Bcl-2家族，Caspase家族等。其中Bcl-2是最為多見的抑凋亡蛋白，Bcl-2可與促凋亡蛋白Bax結(jié)合，使得凋亡信號傳遞出現(xiàn)障礙，增加細(xì)胞存活和增殖速度。Bax還能自身形成二聚體，將細(xì)胞凋亡信號的傳遞至Caspase家族，幫助信號由Caspase-9傳遞至Caspase-3，最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。另外PCNA是一種從系統(tǒng)性紅斑狼瘡中發(fā)現(xiàn)的核內(nèi)多肽，在細(xì)胞周期的G1期表達(dá)，在S期達(dá)到頂峰，是細(xì)胞增殖狀態(tài)評價指標(biāo)之一。Ki67是從兔常規(guī)血清中發(fā)現(xiàn)的一種增殖性細(xì)胞核標(biāo)志物，在G1后期出現(xiàn)，在M期達(dá)到頂峰，與細(xì)胞的有絲分裂密切相關(guān)。因此進(jìn)一步探討miR-221抑制劑對細(xì)胞凋亡調(diào)控相關(guān)蛋白的影響有助于其機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，本研究結(jié)果表明miR-221抑制劑能顯著上調(diào)Bcl-2，PCNA及Ki67表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，同時降低Caspase-3及Caspase-9活性，最終抑制AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡。另外細(xì)胞的凋亡、增殖、分化等生物學(xué)行為受多種信號通路的調(diào)控，ERK就是其中一種。ERK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，在細(xì)胞靜息條件處于細(xì)胞質(zhì)中，一旦被上游信號激活磷酸化后，能轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而參與細(xì)胞的生命活動〔13〕。且有研究證實miR-221與MEK/ERK信號通路密切相關(guān)〔14〕。本研究結(jié)果表明miR-221 inhibitor能通過上調(diào)p-ERK1/2表達(dá)，繼而調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，最終抑制AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡。