滌痰湯對(duì)血管性癡呆大鼠海馬TNF-α、NF-κB、IL-1β、IL-10表達(dá)的影響

楊超 楊佳 劉玲

(1湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061；2湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院老年病科；3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科；4湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院)

滌痰湯治療血管性癡呆(VD)療效確切，但其作用機(jī)制尚不明確。腦缺血引起的炎癥反應(yīng)在VD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演了重要角色〔1〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察滌痰湯對(duì)VD大鼠海馬組織腫瘤壞死因子(TNF)-α、核因子(NF)-κB、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-10表達(dá)的影響探討其治療VD的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康Wistar大鼠40只，鼠齡8～10 w，雄性，體重(200±20)g，購(gòu)自湖北省疾控中心，許可證編號(hào)：SCXK(鄂) 2008-0004。

1.2藥物和試劑 滌痰湯由制半夏8 g，天南星8 g，橘紅5 g，炒枳實(shí)6 g，茯苓6 g，人參3 g，竹茹2 g，石菖蒲3 g，甘草1.5 g，生姜5 g組成，購(gòu)于湖北省中醫(yī)院，分別水煎濃縮成含生藥量0.971 g/ml、0.485 g/ml，無(wú)菌分裝后備用。一抗兔抗大鼠TNF-α和兔抗大鼠NF-κB抗體(abcam公司，英國(guó))、二抗山羊抗兔抗體(abcam公司，英國(guó))；蘇木素-伊紅(HE)染色所需試劑由國(guó)家中醫(yī)藥管理局老年性癡呆(醒腦益智)重點(diǎn)研究室提供；IL-1β、IL-10試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.3儀器 RM2235自動(dòng)切片機(jī)(德國(guó)徠卡)，SA201 Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)，KZ-Ⅱ型勻漿儀(康濤科技有限公司)，DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)，V300型掃描儀(EPSON)，722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，TGL-16C型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.4造模 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，采用改良的永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制備VD大鼠模型：大鼠術(shù)前6 h禁水，12 h禁食，給予10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，剪去頸前部手術(shù)區(qū)域毛發(fā)，消毒，鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，用0號(hào)手術(shù)線結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈的近心端和遠(yuǎn)心端，用剪刀從中間剪斷，依次逐層縫合?？p合后于手術(shù)切口局部皮下注射慶大霉素0.2萬(wàn)U預(yù)防感染。1 w后在同樣條件下，結(jié)扎并剪斷右側(cè)頸總動(dòng)脈。假手術(shù)組分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，但不結(jié)扎。

1.5分組與給藥 將40只大鼠隨機(jī)分為VD模型組、假手術(shù)組、滌痰湯高劑量組、滌痰湯低劑量組，每組10只，造模成功1 w后開(kāi)始灌胃給藥，給藥量均按人與大鼠體表面積系數(shù)比確定。滌痰湯低、高劑量組給藥量為滌痰湯折合生藥量4.85 g/kg、9.71 g/kg，模型組、假手術(shù)組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)4 w。

1.6檢測(cè)方法

1.6.1Morris水迷宮測(cè)試 水迷宮實(shí)驗(yàn)的前1～5 d為定位航行測(cè)試，第6天為空間搜索實(shí)驗(yàn)。定位航行測(cè)試：將各組大鼠按照順時(shí)針的順序從水池的四個(gè)象限放入水中，記錄120 s內(nèi)大鼠從入水到找到平臺(tái)后四肢爬上平臺(tái)并停留超過(guò)10 s所需的時(shí)間(即逃避潛伏期)，每天4次，連續(xù)5 d，取平均值。空間搜索實(shí)驗(yàn)：第6天，將平臺(tái)撤除，將大鼠由任意象限放入水中，記錄大鼠在120 s內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù)及停留時(shí)間。

1.6.2海馬組織形態(tài)學(xué)觀察 Morris水迷宮結(jié)束后當(dāng)天斷頭處死大鼠，冰上迅速取腦組織，留取包含完整海馬的腦段，置于4%多聚甲醛中固定，然后經(jīng)過(guò)脫水、包埋后，制作成4 μm左右厚度的切片，再經(jīng)過(guò)HE染色后觀察海馬組織學(xué)改變。

1.6.3免疫組化法檢測(cè)核因子(NF)-кB的表達(dá) 將上述各組石蠟切片用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，其方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。組織中棕黃色或棕褐色顆粒為目標(biāo)蛋白。在光學(xué)顯微鏡下，每張片子隨機(jī)選取 5 個(gè)視野，采用 Leica Qwin 圖像分析系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白NF-кB的表達(dá)情況(表達(dá)平均灰度=視野灰度 × 陽(yáng)性細(xì)胞比率)。

1.6.4Western印跡法檢測(cè)海馬組織腫瘤壞死因子(TNF)-α蛋白表達(dá) 每組稱取100 mg海馬組織，剪碎、勻漿、離心后，收集上清液，后用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，再進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉(zhuǎn)膜后，在室溫下將膜置于脫色搖床上用5%的脫脂牛奶，封閉2 h。封閉液稀釋一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，TBST洗膜3次，每次10 min。之后加入1∶3 000稀釋二抗，室溫下孵育30 min后，用TBST洗膜3次，每次10 min。電化學(xué)發(fā)光(ECL)化學(xué)顯影、定影及曝光后，Alpha軟件處理系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行分析。

1.6.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)海馬組織白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-10含量 取大鼠海馬組織1 g，按1∶9(大鼠海馬組織∶生理鹽水體積)加入冰生理鹽水，充分研磨制備成海馬組織勻漿。4℃，2 500 r/min離心10 min，吸取上清液，即為海馬組織勻漿。加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕?biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液 100 μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品 100 μl，輕輕晃動(dòng)混勻。棄去液體，甩干。每個(gè)孔中加入生物素化抗體工作液 100 μl。酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min。每孔加酶結(jié)合物工作液100 μl，加上覆膜，37℃溫育30 min。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每孔加底物溶液(TMB)90 μl，酶標(biāo)板加上覆膜 37℃避光孵育15 min左右。每孔加終止液50 μl。立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD值)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯低劑量組、滌痰湯高劑量組的逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05，P<0.01)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組停留時(shí)間及穿越原平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯低、高劑量組停留時(shí)間及穿越原平臺(tái)次數(shù)顯著增加(P<0.05，P<0.01)。與滌痰湯低劑量組比較，滌痰湯高劑量組停留時(shí)間及穿越原平臺(tái)次數(shù)顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2海馬組織病理學(xué)觀察結(jié)果比較 假手術(shù)組海馬區(qū)神經(jīng)元染色均勻，形態(tài)飽滿，邊界清晰，數(shù)量正常，細(xì)胞核呈類圓形，細(xì)胞膜、核膜清楚。模型組海馬區(qū)神經(jīng)元染色不均勻，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞邊界模糊，數(shù)量減少，可見(jiàn)壞死的神經(jīng)元，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞膜、核膜不清晰。與模型組對(duì)比，滌痰湯低劑量組、高劑量組神經(jīng)元染色較均勻，細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，細(xì)胞邊界較清晰，數(shù)量增多。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織病理學(xué)形態(tài)(HE，×400)

2.3NF-кB的表達(dá)結(jié)果比較 與假手術(shù)組相比，模型組NF-кB表達(dá)量明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯低劑量組、滌痰湯高劑量組NF-кB表達(dá)量顯著下降(P<0.05，P<0.01)；與滌痰湯低劑量組比較，滌痰湯高劑量組NF-кB表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組海馬NF-кB表達(dá)灰度及TNF-α相對(duì)表達(dá)量比較

圖2 各組海馬NF-кB蛋白表達(dá)比較(DAB，×400)

2.4海馬組織TNF-α表達(dá)水平 與假手術(shù)組比較，模型組TNF-α的表達(dá)量明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯低劑量組、滌痰湯高劑量組TNF-α表達(dá)量顯著下降(P<0.05，P<0.01)；與滌痰湯低劑量組比較，滌痰湯高劑量組TNF-α表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖3。

圖3 各組海馬TNF-α蛋白的表達(dá)

2.5海馬組織IL-1β、IL-10含量檢測(cè)結(jié)果比較 與假手術(shù)組相比，模型組海馬組織勻漿IL-1β、IL-10含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯低劑量組、滌痰湯高劑量組IL-1β含量降低(P<0.05，P<0.01)，IL-10含量顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與滌痰湯低劑量組比較，滌痰湯高劑量組IL-10含量顯著升高(P<0.05)，IL-1β含量顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組海馬組織勻漿IL-1β、IL-10含量比較

3 討 論

VD屬于中醫(yī)學(xué)“文癡病”、“愚癡病”、“呆癡病”等疾病范疇，清代陳士鐸在《辨證錄》中說(shuō)：“痰積于胸中，盤踞于心外，使神明不清而成呆病矣”，認(rèn)為痰濁在癡呆的發(fā)病中具有關(guān)鍵作用。其所創(chuàng)立的治呆諸方皆以逐痰健脾為要?，F(xiàn)代學(xué)者通過(guò)臨床研究發(fā)現(xiàn)VD患者的認(rèn)知障礙與中醫(yī)痰濁密切相關(guān)〔2,3〕。作為中醫(yī)治療癡呆的經(jīng)典方劑滌痰湯，可逐痰開(kāi)竅、安神定志治療癡呆。本實(shí)驗(yàn)研究表明滌痰湯可改善VD大鼠的認(rèn)知功能障礙，保護(hù)VD大鼠海馬神經(jīng)元。這與我們的前期臨床研究結(jié)果相一致〔4,5〕。作為VD的重要病理學(xué)基礎(chǔ)，慢性腦缺血可引起腦組織炎癥反應(yīng)，損傷大腦神經(jīng)元導(dǎo)致認(rèn)知功能下降〔6～8〕。腦缺血發(fā)生后，局部?jī)?nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元等被激活，釋放IL-1β、TNF-α等炎性因子，進(jìn)一步刺激其他炎性因子的釋放，并誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞進(jìn)入損傷的腦組織，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成神經(jīng)元損傷〔9,10〕，引起認(rèn)知障礙。本實(shí)驗(yàn)表明IL-1β、TNF-α參與了VD大鼠海馬缺血損傷，導(dǎo)致了認(rèn)知障礙；滌痰湯可能通過(guò)抑制IL-1β、TNF-α的表達(dá)減輕海馬神經(jīng)元損傷從而改善認(rèn)知障礙。IL-1β、TNF-α等炎性因子也參與調(diào)節(jié)突觸可塑性，與VD的發(fā)病密切相關(guān)〔11,12〕。NF-кB是炎癥反應(yīng)中重要的核轉(zhuǎn)錄因子。腦缺血時(shí)，IL-1β、TNF-α等刺激NF-кB迅速活化，后者進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與多種炎性反應(yīng)基因的啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)炎性因子的表達(dá)，引起海馬區(qū)炎癥反應(yīng)，損傷神經(jīng)元〔13,14〕，引起海馬損傷及神經(jīng)元-突觸丟失，最終導(dǎo)致認(rèn)知障礙〔15〕。本實(shí)驗(yàn)表明VD的缺血損傷可能導(dǎo)致NF-кB的活化，促進(jìn)海馬組織炎癥反應(yīng)。經(jīng)滌痰湯治療后NF-кB的表達(dá)下降，表明滌痰湯可能通過(guò)抑制NF-кB的表達(dá)緩解海馬組織炎癥提高認(rèn)知水平。IL-10作為腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎因子〔16〕，可通過(guò)抑制缺血后的炎癥反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔17〕，研究表明調(diào)高IL-10的表達(dá)與改善缺血后認(rèn)知障礙密切相關(guān)〔18〕。本實(shí)驗(yàn)中，模型組IL-10的表達(dá)較假手術(shù)組升高，體現(xiàn)了IL-10的保護(hù)效果，但其仍不足以對(duì)抗其他眾多促炎因子的作用，導(dǎo)致抑炎因子與促炎因子之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。在給予滌痰湯后，VD大鼠海馬組織中IL-10的含量升高，進(jìn)一步增強(qiáng)了抑炎因子的作用，緩解了大鼠海馬組織的損傷，改善VD大鼠認(rèn)知障礙。