羽扇豆醇通過NF-κb信號(hào)通路調(diào)控胃癌小鼠免疫微環(huán)境

姜瑞 陳佳 侯向紅

(甘肅省人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心，甘肅 蘭州 730000)

胃癌發(fā)病率位居我國(guó)惡性腫瘤的首位〔1〕。研究指出，我國(guó)每年新增胃癌病例約68萬，占全球每年新增胃癌病例的42%，且死亡率已超過世界平均水平的2倍〔2〕。目前臨床上針對(duì)胃癌患者常采用手術(shù)、放化療和靶向治療等，但手術(shù)有明顯局限性，且各種方案的綜合療效不甚理想〔3,4〕，尚需探討新的治療方案。腫瘤微環(huán)境是指腫瘤細(xì)胞所處的內(nèi)環(huán)境，腫瘤細(xì)胞可通過自分泌與旁分泌改變并維持自身生存和進(jìn)展，全身與局部組織亦可通過調(diào)節(jié)分泌、代謝、免疫等影響腫瘤生長(zhǎng)。有報(bào)道指出，核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κb包括5種亞基，其中包括NF-κb p65，在致病因素刺激下NF-κb p65活化，與此同時(shí)腫瘤組織T細(xì)胞活化，可分泌大量的白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α等，而此類因子均有免疫抑制作用，進(jìn)而可參與惡性腫瘤細(xì)胞免疫逃逸〔5〕。因此調(diào)節(jié)胃癌免疫微環(huán)境是抑制腫瘤生長(zhǎng)的可行途徑。羽扇豆醇是從羽扇豆種子的表皮、無花果樹等提煉的，可抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫。有研究顯示，羽扇豆醇可抑制抗原遞呈細(xì)胞的成熟與活化，下調(diào)TNF-α表達(dá)，治療急性移植物抗宿主病〔6〕。另有研究推測(cè)羽扇豆醇有抗消化系統(tǒng)惡性腫瘤的作用且很可能是通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境實(shí)現(xiàn)的〔7〕。但羽扇豆醇是否可通過調(diào)節(jié)NF-κb通路調(diào)控胃癌荷瘤小鼠的免疫微環(huán)境發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)尚不可知。本研究旨在探討羽扇豆醇通過NF-κB信號(hào)通路調(diào)控胃癌小鼠免疫微環(huán)境的作用。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物：小鼠胃癌細(xì)胞株MFC購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司；C57BL/6J雄性小鼠50只，清潔級(jí)，7～9周齡，18～22 g，購(gòu)自上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2019-0003。

藥品與試劑：羽扇豆醇(上海丹施生物科技有限公司，純度>98%)；常山酮(成都彼樣生物科技有限公司，純度>98%)；膜聯(lián)蛋白V(Annexin)V-FITC、碘化丙啶(PI)染料(南京沃博生物科技有限公司，批號(hào)：1912101、1911017)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京酷來搏科技有限公司，批號(hào)：1910118)；Trizol試劑(上海聯(lián)邁生物工程有限公司，批號(hào)：1910154A)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(蘇州宇恒生物科技有限公司，批號(hào)：1911014102)；NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α、β-actin(內(nèi)參)上下游序列(委托大連寶生物科技有限公司合成)；蛋白定量試劑盒(上海雅酶生物科技有限公司，批號(hào)：1911142018)；兔抗鼠NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α單克隆抗體(Abcam中國(guó)公司，批號(hào)：1911014、1910185、1912148、1912136)；酶標(biāo)記的山羊抗兔NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α多克隆抗體(Abcam公司，批號(hào)：1910102、1911107、1912186、1912192)。實(shí)驗(yàn)設(shè)備：TDZ5-BP型醫(yī)用離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘銳離心機(jī)有限公司)；530-119型游標(biāo)卡尺(昆山艾弗特計(jì)量?jī)x器有限公司)；JY10001型電子天平(上海精密儀器儀表有限公司)；BriCyte E6型流式細(xì)胞儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；RM2235型切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)；CX33型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；Mastercycler nexus flat型聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(Eppendorf中國(guó)有限公司)；ZF208型凝膠圖像成像分析系統(tǒng)(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2方法 建模與分組干預(yù)：取小鼠胃癌細(xì)胞株MFC，常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，待細(xì)胞接近80%進(jìn)行消化，收集懸液至離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清液以0.9%生理鹽水重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×107個(gè)/ml。對(duì)小鼠右后肢脫毛，取0.2 ml注射于其右后肢外側(cè)皮下，0.2 ml/只。隔日用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下移植瘤長(zhǎng)徑與短徑，計(jì)算腫瘤體積，1 w后腫瘤體積>50 mm3計(jì)為建模成功〔8〕。50只小鼠有48只建模成功，建模成功率為96.00%(48/50)。將建模成功小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表分為5組，模型組、常山酮組各9只，羽扇豆醇低、中、高劑量組各10只。模型組予以1 ml/100 g體重?zé)o菌生理鹽水腹腔注射，常山酮組予以2 μg常山酮溶于0.1 ml/100 g體重?zé)o菌生理鹽水中腹腔注射，羽扇豆醇低、中、高劑量組予以10、20、40 mg/kg羽扇豆醇溶于0.1 ml/100 g體重?zé)o菌生理鹽水中腹腔注射，1次/d，持續(xù)1 w。

腫瘤質(zhì)量及免疫微環(huán)境指標(biāo)檢測(cè)：干預(yù)后采用斷頭法處死小鼠，處死前收集尾靜脈血，處死后迅速取胸腺、脾臟、癌組織和癌旁組織。采用電子天平稱量腫瘤、胸腺、脾臟質(zhì)量，計(jì)算胸腺、脾臟質(zhì)量指數(shù)；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組外周血、胸腺、脾臟、癌組織和癌旁組織CD3+CD4+、CD3+CD8+、Treg、自然殺傷(NK)細(xì)胞占比，所用方法為Annexin V-FITC/PI雙染法，并計(jì)算CD4+/CD8+。

癌組織病理改變觀察：取腫瘤組織沖洗干凈后固定，常規(guī)脫水、透明處理，石蠟包埋后連續(xù)切片(層厚4 μm)，烤片后脫蠟，水化，蘇木素染色后伊紅復(fù)染，脫水、透明、封片，采用光學(xué)顯微鏡觀察，其中HE染色需要嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書操作。

癌組織NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA表達(dá)檢測(cè)：采用液氮研磨腫瘤組織并勻漿，提取總mRNA，檢測(cè)并鑒定，結(jié)果為1.8～2.0視為合格，將其逆轉(zhuǎn)錄后配制反應(yīng)體系，其中NF-κb p65上游序列：5′-TGCTAGAGCTATTATAGCT-3′，下游序列：5′-ATGCTTAGAGGCGCGGCTATA-3′；IL-6上游序列：5′-CTGGATATAGGCGCGGCATAT-3′，下游序列：5′-CGGGCTATATAGCGGCTAGCTA-3′；IL-10上游序列：5′-TCGCGTATATGCGTATAGCTAG-3′，下游序列：5′-ATCGCTATAGCTATTAGCGCTAGCT-3′；TNF-α上游序列：5′-CGCGTATATAGGCTATATGGCGCG-3′，下游序列：5′-CTGGAAGTCTTCGAGAGCTAG-3′；β-actin上游序列：5′-AGAGCTCTTCGAGAG-3′，下游序列：5′-TAGAGCTCTCTAGAGCT-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為：312 bp、320 bp、348 bp、390 bp、280 bp。擴(kuò)增反應(yīng)流程：92℃(10 min)，35個(gè)循環(huán)：95℃(10 s)、60℃(30 s)、95℃(15 s)、75℃(15 s)，最后72℃(5 min)，計(jì)算2-△△Ct。

癌組織NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用Western印跡檢測(cè)。取腫瘤組織研磨勻漿，加入蛋白裂解液，提取總蛋白，定量檢測(cè)。上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，加入一抗，4℃冰箱中孵育過夜；洗脫后加入二抗，室溫孵育2 h。洗脫后加入電化學(xué)發(fā)光液。采用凝膠圖像成像分析系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠腫瘤質(zhì)量比較 常山酮組〔(3.02±0.56)g〕和羽扇豆醇低、中、高劑量組腫瘤質(zhì)量〔(3.00±0.52)g、(2.71±0.42)g、(2.05±0.37)g〕均顯著低于模型組〔(4.85±0.73)g，P<0.05〕，羽扇豆醇中、高劑量組腫瘤質(zhì)量均顯著低于常山酮組、羽扇豆醇低劑量組(P<0.05)，羽扇豆醇高劑量組腫瘤質(zhì)量顯著低于羽扇豆醇中劑量組(P<0.05)。

2.2各組胸腺、脾臟質(zhì)量指數(shù)比較 常山酮組和羽扇豆醇各劑量組胸腺、脾臟質(zhì)量指數(shù)均顯著高于模型組(P<0.05)，羽扇豆醇中、高劑量組胸腺、脾臟質(zhì)量指數(shù)均顯著高于常山酮組、羽扇豆醇低劑量組(P<0.05)，羽扇豆醇高劑量組胸腺、脾臟質(zhì)量指數(shù)均高于羽扇豆醇中劑量組(P<0.05)，見表1。

表1 各組胸腺、脾臟質(zhì)量指數(shù)比較

2.3各組免疫指標(biāo)比較 外周血、胸腺、脾臟CD3+CD4+、NK細(xì)胞、CD4+/CD8+，癌組織CD4+/CD8+，癌旁組織CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK細(xì)胞、CD4+/CD8+比較，常山酮組和羽扇豆醇各劑量組均顯著高于模型組(P<0.05)，羽扇豆醇中、高劑量組均顯著高于常山酮組、羽扇豆醇低劑量組(P<0.05)，羽扇豆醇高劑量組均高于羽扇豆醇中劑量組(P<0.05)；外周血、胸腺、脾臟Treg，癌組織CD3+CD4+、CD3+CD8+、Treg、NK細(xì)胞，癌旁組織Treg比較，常山酮組和羽扇豆醇各劑量組均顯著低于模型組(P<0.05)，羽扇豆醇中、高劑量組均顯著低于常山酮組、羽扇豆醇低劑量組(P<0.05)，羽扇豆醇高劑量組均顯著低于羽扇豆醇中劑量組(P<0.05)，見表2～6。

表2 各組外周血細(xì)胞免疫指標(biāo)比較

表3 各組胸腺細(xì)胞免疫指標(biāo)比較

表4 各組脾臟細(xì)胞免疫指標(biāo)比較

表5 癌組織細(xì)胞免疫指標(biāo)比較

表6 癌旁組織細(xì)胞免疫指標(biāo)比較

2.4各組腫瘤組織病理改變比較 模型組腫瘤細(xì)胞排列不規(guī)則，異型性明顯，間質(zhì)有充血水腫和炎癥浸潤(rùn)，腺體呈囊狀擴(kuò)張；常山酮組和羽扇豆醇低劑量組部分腫瘤細(xì)胞排列不規(guī)則，有異型性，間質(zhì)有充血水腫和炎癥浸潤(rùn)表現(xiàn)；羽扇豆醇中劑量組少部分腫瘤細(xì)胞排列不規(guī)則且有異型性，間充質(zhì)有輕微充血水腫和炎癥浸潤(rùn)表現(xiàn)；羽扇豆醇高劑量組腫瘤細(xì)胞基本排列規(guī)則，細(xì)胞異型性不明顯，間充質(zhì)無充血水腫和炎癥浸潤(rùn)表現(xiàn)。見圖1。

圖1 各組腫瘤組織病理改變(HE，×100)

2.5各組癌組織NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA及蛋白表達(dá)比較 癌組織NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA及蛋白表達(dá)比較，常山酮組和羽扇豆醇各劑量組均顯著低于模型組(P<0.05)，羽扇豆醇中、高劑量組均顯著低于常山酮組、羽扇豆醇低劑量組(P<0.05)，羽扇豆醇高劑量組均顯著低于羽扇豆醇中劑量組(P<0.05)，見表7，圖2。

表7 各組癌組織NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA及蛋白表達(dá)比較

1～5:模型組,常山酮組,羽扁豆醇低劑量組,羽扁豆醇中劑量組,羽扁豆醇高劑量組圖2 各組癌組織NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α蛋白表達(dá)

3 討 論

胃癌的發(fā)生與致病微生物感染、飲食中致癌物超標(biāo)、遺傳因素等均相關(guān)，可通過直接浸潤(rùn)、血行轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移和腹膜種植等途徑擴(kuò)散〔9,10〕。有研究指出〔11〕，胃癌細(xì)胞可通過多種途徑逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別與攻擊，稱為免疫逃逸，常見的機(jī)制有腫瘤細(xì)胞抗原缺失及抗原改變、腫瘤細(xì)胞共刺激信號(hào)異常、腫瘤細(xì)胞表達(dá)或分泌免疫抑制因子、誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡或抑制其活化、抑制機(jī)體免疫應(yīng)答等。另有研究顯示〔12〕，腫瘤免疫微環(huán)境與病情發(fā)展和預(yù)后均相關(guān)，改善腫瘤免疫微環(huán)境有助于增強(qiáng)抗腫瘤效果，改善預(yù)后。常山酮是從常山中獲取的喹唑酮類物質(zhì)，有報(bào)道〔13〕顯示常山酮可調(diào)節(jié)小鼠的免疫微環(huán)境，且該藥物在臨床抗腫瘤治療中也顯示出良好的應(yīng)用價(jià)值〔14〕，故而本研究選用常山酮作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。本研究結(jié)果提示常山酮和羽扇豆醇均促進(jìn)胃癌小鼠機(jī)體細(xì)胞免疫，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胃癌細(xì)胞的識(shí)別和免疫殺傷效應(yīng)，且羽扇豆醇的作用呈劑量依賴性；本研究結(jié)果常山酮和羽扇豆醇均可促使CD3+CD4+、CD3+CD8+、Treg、NK細(xì)胞進(jìn)入癌組織發(fā)揮抗腫瘤作用，而在發(fā)揮此作用的同時(shí)上述細(xì)胞可被大量消耗，因此癌組織中CD3+CD4+、CD3+CD8+、Treg、NK細(xì)胞水平顯著下降。T細(xì)胞是抗腫瘤免疫中的主力軍，有免疫記憶功能和特異性，而NK細(xì)胞和Treg細(xì)胞也有重要的抗腫瘤作用，分別負(fù)責(zé)非特異性抗腫瘤和機(jī)體內(nèi)負(fù)向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、維持機(jī)體免疫平衡〔15〕。有研究顯示〔16，17〕，T細(xì)胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+可通過多種途徑抑制腫瘤生長(zhǎng)，其中前者水平升高可活化的T細(xì)胞分泌大量的IL-6、IL-10和TNF-α等，既可直接破壞腫瘤細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，還可增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤作用；后者則是主要的細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞，當(dāng)CD4+/CD8+升高意味著機(jī)體免疫應(yīng)答及抗腫瘤活性增強(qiáng)，可避免腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。相關(guān)報(bào)道〔18〕發(fā)現(xiàn)對(duì)肝癌荷瘤小鼠予以藥物治療調(diào)控免疫微環(huán)境可增加抑瘤率，且本研究與該報(bào)道中的外周血、脾臟、腫瘤組織及癌旁組織T細(xì)胞免疫指標(biāo)變化趨勢(shì)相符。本研究結(jié)果表明常山酮和羽扇豆醇均可通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境發(fā)揮抗胃癌作用，且羽扇豆醇的作用呈劑量依賴性。T細(xì)胞活化可分泌大量的細(xì)胞因子，進(jìn)而通過各種途徑發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。本研究結(jié)果表明常山酮和羽扇豆醇均可抑制癌組織中NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)。NF-κb p65是一種可與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強(qiáng)子κb序列特異性結(jié)合的和蛋白因子，可由TNF-α受體家族成員激活〔19〕。結(jié)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道〔20～22〕，NF-κb p65可通過多種途徑參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展，包括激活炎癥反應(yīng)、抑制免疫應(yīng)答、參與血管生成、細(xì)胞黏附、細(xì)胞自噬、能量代謝等，可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，延長(zhǎng)細(xì)胞存活期。另有報(bào)道指出〔23〕，NF-κb p65激活可促進(jìn)T細(xì)胞活化，增強(qiáng)IL-6、IL-10和TNF-α的表達(dá)。但是本研究常山酮組和羽扇豆醇各劑量組癌組織中IL-6、IL-10、TNF-α mRNA和蛋白降低，可能是由于CD3+CD4+、Treg、NK細(xì)胞等進(jìn)入癌組織后大量被消耗以發(fā)揮抗腫瘤作用，因此腫瘤生長(zhǎng)被抑制，與此同時(shí)IL-6、IL-10、TNF-α的活性下降。羽扇豆醇是一種三萜烯，已被證實(shí)有抗氧化、抗炎、抗惡性腫瘤細(xì)胞增殖和遷移等作用，且該藥物可調(diào)節(jié)荷瘤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)〔24〕，增強(qiáng)免疫應(yīng)答，抑制惡性腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。

綜上，常山酮和羽扇豆醇均可抑制胃癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)，還可調(diào)節(jié)整體細(xì)胞免疫和局部細(xì)胞免疫指標(biāo)水平，增強(qiáng)免疫應(yīng)答，抑制腫瘤免疫逃逸，推測(cè)是通過抑制NF-κb p65表達(dá)，并通過該通路下調(diào)IL-6、IL-10、TNF-α的表達(dá)實(shí)現(xiàn)此作用的。本研究為胃癌免疫調(diào)節(jié)治療研究提供了新方向，但羽扇豆醇是否可通過其他信號(hào)通路途徑調(diào)節(jié)胃癌免疫微環(huán)境尚不清楚，后期仍需深入研究和探討，以充分挖掘羽扇豆醇的醫(yī)用價(jià)值。