miR-181c-5p通過靶向NDRG2調(diào)節(jié)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生物學(xué)活性

王鐵峰 王剛 牛占峰

(1海南省第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科，海南 五指山 572299；2寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科)

人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是常見的人腦內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，具有極高的發(fā)病率和死亡率〔1〕。當(dāng)前已有多種能夠治療膠質(zhì)瘤的方法，如藥物治療、手術(shù)治療等，但仍具有一定的缺陷性，治療效果不佳〔2，3〕。MicroRNA是一種廣泛分布的內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的小RNAs(約為22個(gè)核苷酸)，其特點(diǎn)是可以結(jié)合到mRNA的3′UTR端來發(fā)揮其負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的作用〔4〕?，F(xiàn)已證實(shí)，miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有緊密聯(lián)系〔5〕。已有研究表明，miRNA在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中具有差異性表達(dá)，并在細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡中扮演重要角色。miR-128通過靶向ARP5/Bmi-1/E2F-3a從而調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖〔6〕。miR-328通過靶向ABCG2降低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的耐藥性〔7〕。miR-125a-5p通過靶向TAZ可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖并促進(jìn)其進(jìn)行分化〔8〕。miR-181c-5p也是miRNA家族中的一員，已有研究發(fā)現(xiàn)miR-181c-5p在多種疾病的發(fā)生中具有重要作用，LncRNA可通過miR-181c-5p競爭性結(jié)合從而調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬〔9〕。miR-181c-5p通過調(diào)控白血病抑制因子從而調(diào)控高糖介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙〔10〕。miR-181c-5p通過靶向SMAD7調(diào)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生物學(xué)活性〔11〕。但miR-181c-5p在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制目前還不清楚。本研究擬分析miR-181c-5p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)及對其生物學(xué)活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87購于美國ATCC公司；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均購于Sigma；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于凱基生物科技公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR檢測試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；雙熒光素酶報(bào)告檢測試劑盒購于promega公司；NDRG2-3′UTR和NDRG2-3′UTR MUT由擎科生物有限公司設(shè)計(jì)；miR-181c-5p mimics及NC-mimics、 miR-181c-5p inhibitor及NC-inhibitor由上海吉瑪制藥公司設(shè)計(jì)并合成。CCK-8試劑盒購于上海碧云天生物有限公司；Transwell孔板購于康寧；NDRG2、GAPDH等抗體購于碧云天生物。

1.2臨床樣本 從在醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中，收集30例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織樣本及鄰近的正常組織樣本。組織離體后在液氮中進(jìn)行快速冷凍，在使用臨床樣本實(shí)驗(yàn)前應(yīng)對其進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色鑒定。本研究已獲得倫理委員會批準(zhǔn)，并在取樣時(shí)得到了患者許可。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞在含有2.5%FBS、5%馬血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2條件培養(yǎng)。每3天進(jìn)行一次換液。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)即可用于進(jìn)行其他生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

將處于對數(shù)生長期的U87細(xì)胞接種至6孔板中，每孔約2×105個(gè)細(xì)胞。然后使用轉(zhuǎn)染效率穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，miR-181c-5p mimics組、miR-181c-5p inhibitor組、NC-mimics組、NC-inhibitor組及對照組分別將miR-181c-5p mimics、miR-181c-5p inhibitor及相對應(yīng)的陰性對照(NC-mimics、NC-inhibitor)及等量的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)入U(xiǎn)87細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染結(jié)束后在培養(yǎng)條件下進(jìn)行72 h培養(yǎng)。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 根據(jù)TRIzol Reagent 使用說明書操作提取人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織及U87細(xì)胞中的總RNA，然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-181c-5p：上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGAACA-3′，下游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6：上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′，下游引物5′-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3′；NDRG2：上游引物5′-CTGGAACAGCTACAACAACC-3′，下游引物5′-CCCCTCAGCTATAGACACCT-3′；GAPGH：上游引物5′-GGTGAAGGCGGAGTCAACG-3′，下游引物5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′。按照說明書配制qRT-PCR體系，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(95℃ 5 s，60℃ 20 s)。以GAPGH為NDRG2內(nèi)參，U6為miR-181c-5p的內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算miR-181c-5p、NDRG2的相對表達(dá)。

1.5Western印跡檢測蛋白表達(dá)情況 使用組織/細(xì)胞裂解液對組織/細(xì)胞進(jìn)行裂解，然后收集總蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。分別取20 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PDVF)膜上，然后使用5%脫脂奶粉對其進(jìn)行1 h封閉，使用1倍磷酸鹽緩沖液(PBS)將膜清洗3次。加入相應(yīng)的一抗置于4℃搖床過夜孵育，清洗后，加入二抗進(jìn)行室溫孵育1 h，清洗后加入ECL顯影液顯影。

1.6CCK-8檢測細(xì)胞增殖 鋪處于生長期的U87細(xì)胞至96孔板中，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，然后向每個(gè)孔中加入10 μl CCK-8試劑并混勻，并設(shè)置空白對照。37℃下避光孵育1 h，使用酶標(biāo)儀測定波長450 nm的吸光度值。

1.7Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲 取處于生長期的U87細(xì)胞至24孔板中，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h。使用胰酶消化U87細(xì)胞并用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，使用臺盼藍(lán)染色技術(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為2×108/L，然后取細(xì)胞懸液100 μl加至Transwell小室上層向，Transwell小室下層中加入500 μl 10%血清完全培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24 h后取出小室，1倍PBS清洗后用棉簽輕輕擦除上室中未發(fā)生遷移的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定20 min，1倍PBS清洗3次后使用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，1倍PBS清洗后，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)下室染色細(xì)胞。

將提前凍存的基質(zhì)膠置于4℃直至溶成液態(tài)，使用400 μl無血清培養(yǎng)基對50 μl基質(zhì)膠原液進(jìn)行稀釋并輕輕搖晃混勻。取50 μl稀釋液加至Transwell小室的上室中，置于37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，當(dāng)凝固后加入100 μl無血清培養(yǎng)基浸潤凝膠，吸棄，后續(xù)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。通過計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)來反映細(xì)胞侵襲能力。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取處于生長期的U87細(xì)胞至24孔板中，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h。使用不含EDTA的胰酶消化U87細(xì)胞并用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸。1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，加入500 μl 1倍結(jié)合緩沖液對細(xì)胞進(jìn)行重懸，再加入5 μl Annexin V-FITC、10 μl PI并輕輕搖晃混勻，室溫避光5 min后使用流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計(jì)各組凋亡率。

1.9生物信息學(xué)預(yù)測miR-181c-5p的靶基因 通過生物信息學(xué)網(wǎng)站miRBD和targetscan聯(lián)合預(yù)測miR-181c-5p的靶基因。

1.10雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 取GIST-T1細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000按說明書操作進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，然后將細(xì)胞分為4組：野生型質(zhì)粒對照組(轉(zhuǎn)染mimics-NC和NDRG2-3′ UTR)、野生型實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染miR-181c-5p mimics和NDRG2-3′ UTR)、突變型質(zhì)粒對照組(轉(zhuǎn)染mimics-NC和NDRG2-3′ UTR MUT)、突變型質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染miR-181c-5p mimics和NDRG2-3′ UTR MUT)。對其培養(yǎng)24 h后裂解細(xì)胞，并按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GRAPDprism6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-181c-5p在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) 與正常組織(0.88±0.13)相比，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的miR-181c-5p(1.80±0.20)顯著上調(diào)(P<0.01)。

2.2miR-181c-5p可以調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生物學(xué)功能 與對照組相比，miR-181c-5p mimics組的U87細(xì)胞中miR-181c-5p顯著增加(P<0.001)，而NC mimics組與對照組無明顯差異(P<0.05)。與對照組相比，miR-181c-5p inhibitor組中miR-181c-5p表達(dá)顯著降低(P<0.001)。見表1。

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-181c-5p mimics組的U87細(xì)胞吸光度顯著增加(P<0.01)，而NC-mimics組與對照組沒有顯著差異性(P>0.05)；與對照組相比，miR-181c-5p-inhibitor組U87細(xì)胞吸光度顯著下降(P<0.05)，而NC-inhibitor與對照組無明顯差異(P>0.05)。

Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示，與對照組相比，miR-181c-5p mimics組的U87細(xì)胞遷移率、侵襲率顯著上升(P<0.01,P<0.05)，而NC組與對照組沒有顯著差異性(P>0.05)；與對照組相比，miR-181c-5p-inhibitor組U87細(xì)胞遷移率、侵襲率顯著下降，而NC-inhibitor與對照組沒有顯著差異性(P>0.05)。見表1、圖1、圖2。與對照組相比，miR-181c-5p mimics組的U87細(xì)胞凋亡率下降(P<0.01)，而NC-mimics組與對照組沒有差異性(P>0.05)；與NC-inhibitor組相比，miR-181c-5p-inhibitor組U87細(xì)胞凋亡率增加(P<0.01)，而NC-inhibitor與對照組沒有差異性(P>0.05)。見表1、圖3。

圖1 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(結(jié)晶紫染色，×40)

圖2 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(結(jié)晶紫染色，×40)

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測U87細(xì)胞凋亡

表1 miR-181c-5p可調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的生物學(xué)活性

2.3miR-181c-5p的靶基因 通過生物信息學(xué)在線分析軟件miRbase和Targetscan預(yù)測miR-181c-5p的靶基因，結(jié)果顯示NDRG2可能是miR-181c-5p的靶基因，存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)(圖4)。通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，miR-181c-5p mimics組NDRG2 3′UTR的相對熒光素酶活性明顯受到抑制，而NDRG2 3′UTR MUT的相對熒光素酶活性沒有明顯的抑制作用。見表2。

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)分析miR-181c-5p與NDRG2間的靶向結(jié)合作用

圖4 miR-181c-5p與NDRG2間的結(jié)合序列

2.4miR-181c-5p對NDRG2基因的表達(dá)調(diào)控 與對照組相比，U87細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-181c-5p mimics后可顯著下調(diào)NDRG2 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)。而NC-mimics組與對照組沒有差異性(P>0.05)；與對照組組相比，U87細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-181c-5p-inhibitor可上調(diào)NDRG2 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)，而NC-inhibitor與對照組沒有差異性(P>0.05)。見圖5、表3。

圖5 Western印跡檢測NDRG2蛋白表達(dá)

表3 qRT-PCR檢測miR-181c-5p mimics、NC-mimics轉(zhuǎn)染后NDRG2 mRNA表達(dá)

3 討 論

人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是常見的腦部惡性腫瘤之一，其復(fù)發(fā)性高，死亡率高。已通過分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、病理學(xué)等方法的結(jié)合對其進(jìn)行了探究，為臨床治療該疾病提供了許多價(jià)值資料。

miRNA是一種約22個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的小RNAs，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系〔12〕。能夠通過與靶基因的mRNA 3′UTR區(qū)域直接結(jié)合進(jìn)而調(diào)控腫瘤發(fā)生中的生物學(xué)活性，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞凋亡等〔13，14〕。研究表明，多種miRNA在GSM發(fā)生發(fā)展中更具有重要作用，如miR-181d〔15〕、miRNA-154-5p〔16〕、miR-21〔17〕、miR-429〔18〕等。本研究與前期研究結(jié)果一致〔19〕，表明miR-181c-5p在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。在U87細(xì)胞中進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-181c-5p的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲且抑制細(xì)胞凋亡。通過生物信息學(xué)在線分析網(wǎng)站預(yù)測出NDRG2是miR-181c-5p的靶基因，能夠與NDRG2 3′UTR區(qū)域結(jié)合而影響生物學(xué)活性。并通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-181c-5p可以直接結(jié)合NDRG2 3′UTR區(qū)域且這種結(jié)合是靶向抑制的。研究表明NDRG2作為NDRG家族的重要成員，在參與組織胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化及血液免疫中具有重要作用，同時(shí)也與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)〔11，20～24〕。Deng等〔25〕研究表明在膠質(zhì)瘤中NDRG2表達(dá)下調(diào)，與本研究結(jié)果一致。

綜上，miR-181c-5p通過靶向抑制NDRG2的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)人膠質(zhì)細(xì)胞瘤的生物學(xué)活性。miR-181c-5p成為治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的潛在靶點(diǎn)。