補(bǔ)陽還五湯對腦出血大鼠腦組織HIF-1α、SDF-1、CXCR-4表達(dá)的影響

畢紅東 江思瑜 李寶群 苗光新 吳曉光

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

腦出血是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)出血，目前治療的主要入手點(diǎn)為防止占位效應(yīng)和進(jìn)一步出血的擴(kuò)展(如急性溶栓或手術(shù)移除血腫等)〔1〕，但是患者的治療效果不盡人意，嚴(yán)重威脅人類健康，故轉(zhuǎn)變治療方向意義重大。近年來，隨著對腦出血機(jī)制的進(jìn)一步研究，有學(xué)者〔2〕提出提高腦出血患者的神經(jīng)細(xì)胞存活度、穩(wěn)定神經(jīng)細(xì)胞功能或可能成為治療腦出血的新入手點(diǎn)。補(bǔ)陽還五湯方劑由清代名醫(yī)王清任始創(chuàng)，是補(bǔ)氣活血的良方，具有益氣活血通絡(luò)之功效，在促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)、拮抗腦損傷方面具有一定作用，能夠有效治療半身不遂等病癥，分析其作用機(jī)制可能與抗血栓、抑制細(xì)胞凋亡、減輕鈣超載和抗氧化應(yīng)激及促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)等多個方面〔3,4〕有關(guān)。自噬作為一種決定細(xì)胞存活和死亡的新機(jī)制在腦出血損傷中扮演重要作用，但尚無補(bǔ)陽還五湯對自噬相關(guān)蛋白缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1α、趨化因子受體(CXCR)4及其下游通路的研究。本研究主要觀察補(bǔ)陽還五湯對腦出血大鼠腦組織內(nèi)HIF-1α、SDF-1、CXCR4表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級，雄性，SD大鼠，體重280～320 g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號SCXK(京)2012-0001)。

1.2藥物及試劑 補(bǔ)陽還五湯(黃芪120 g、當(dāng)歸尾6 g、赤芍4.5 g、川芎4.5 g、干地龍3 g、桃仁3 g、紅花3 g)購自北京同仁堂承德分公司；銀杏葉片(煙臺榮昌制藥有限公司，批號140404)。HIF-1α兔抗多克隆抗體(Bioworlde，BS3514)，SDF-1α、CXCR4兔抗大鼠多克隆免疫組化試劑盒，Beclin-1一抗，TUNEL凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為BA1389、BA0761、PB0014、MK1024)。

1.3儀器 雙臂數(shù)顯腦立體定位系統(tǒng)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，BWSSa907型柔性骨鉆(上海軟隆科技發(fā)展有限公司)，AHB-LB-2型萬能研究顯微鏡(德國萊卡公司)，Ti-u型熒光顯微鏡(日本尼康公司)，DYCP-35型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.4動物模型制備及分組給藥 72只大鼠隨機(jī)等分為：假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽還五湯組和銀杏葉片組。其中模型組、補(bǔ)陽還五湯組、銀杏葉片組腦出血大鼠模型采用改良Rosenberg法〔5〕法制備：10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，大鼠頂正中行矢狀切口，剝離軟組織及筋膜，暴露前囟點(diǎn)和矢狀縫。在位于前囟點(diǎn)前2.0 mm，矢狀縫右側(cè)旁開3.0 mm處用三棱針鉆一直徑大約為1.0 mm的小孔。借助立體定向儀利用微量注射器沿鉆孔垂直進(jìn)針6.0 mm，注入大鼠自體動脈血80 μl，留針10 min后緩慢拔針，碘伏消毒手術(shù)區(qū)后，縫合切口。假手術(shù)組僅顱骨鉆孔，進(jìn)針，不注射任何物質(zhì)。術(shù)后24 h，補(bǔ)陽還五湯組、銀杏葉片組的大鼠分別灌胃給予26 g/(kg·d)和3.5 mg/(kg·d)，每日1次，共14 d，假手術(shù)組及模型組相應(yīng)灌胃給予等量生理鹽水。

1.5蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡檢測 在末次給藥1 h后，大鼠斷頭取視交叉至大腦橫列腦組織，10%甲醛固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚冠狀切片，利用免疫組化法檢測HIF-1α、SDF-1α、CXCR-4蛋白的表達(dá)變化。采用Western印跡法來檢測Beclin-1蛋白的表達(dá)變化。采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡的變化。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1HIF-1α陽性細(xì)胞表達(dá)變化 與假手術(shù)組比較，模型組腦組織內(nèi)HIF-1α蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組、銀杏葉片組的大鼠腦組織HIF-1α蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 補(bǔ)陽還五湯對腦出血大鼠腦組織 HIF-1α、Beclin-1表達(dá)及TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)的影響

圖1 補(bǔ)陽還五湯對腦出血大鼠HIF-1α蛋白表達(dá)的影響(免疫組化，×400)

2.2細(xì)胞凋亡數(shù)量的變化 TUNEL陽性表達(dá)為呈棕黃色顆粒，位于細(xì)胞核。與假手術(shù)組比較，模型組血腫周圍皮質(zhì)TUNEL陽性細(xì)胞顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組和銀杏葉片組腦組織TUNEL陽性表達(dá)顯著減少(P<0.05)。見表1。

2.3Beclin-1的變化 與假手術(shù)組比較，模型組的Beclin-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組、銀杏葉片組的Beclin-1蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。 見表1。

2.4SDF-1α、CXCR4陽性細(xì)胞表達(dá)變化 模型組、補(bǔ)陽還五湯組及銀杏葉片組SDF-1α、CXCR4陽性細(xì)胞數(shù)均顯著高于假手術(shù)組，且補(bǔ)陽還五湯組及銀杏葉片組陽性細(xì)胞數(shù)目高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 補(bǔ)陽還五湯對大鼠腦出血后SDF-1α、CXCR4陽性細(xì)胞數(shù)的影響個/視野)

3 討 論

中醫(yī)方面將腦出血?dú)w于“中風(fēng)”范疇，病機(jī)關(guān)鍵為元?dú)獠蛔?、瘀血阻絡(luò)，能夠?qū)颊哳A(yù)后造成影響的主要因素為治療方式的選擇與腦損傷的程度。腦卒中患者損傷的神經(jīng)細(xì)胞中都出現(xiàn)了明顯的自噬現(xiàn)象，這提示自噬激活或是腦缺血損傷早期的一種潛在保護(hù)機(jī)制；另外，在對大腦出現(xiàn)缺血情況大鼠進(jìn)行預(yù)處理以后，大鼠腦組織的梗死面積顯著減少，提示腦組織發(fā)生缺血以后神經(jīng)元細(xì)胞的自噬過程能夠被誘導(dǎo)，進(jìn)而啟動細(xì)胞自身的降解過程〔6〕。本研究結(jié)果提示補(bǔ)陽還五湯可通過抑制細(xì)胞的凋亡改善腦出血狀態(tài)。

HIF-1是一種異源二聚體的DNA結(jié)合蛋白，其中α亞基定位于胞質(zhì)并在細(xì)胞缺氧時濃度升高，而β亞基定位于胞核且濃度穩(wěn)定〔7〕。腦組織受內(nèi)、外力影響而出現(xiàn)阻塞或是破裂時將引起HIF-1α的表達(dá)升高，陳錦艷等〔8〕發(fā)現(xiàn)在腦出血大鼠模型中HIF-1α水平的升高，其原因可能與腦出血后造成局部腦組織缺血缺氧。本研究結(jié)果驗(yàn)證了HIF-1α參與腦出血損傷這一觀點(diǎn)。有學(xué)者〔9〕證實(shí)了HIF-1α參與了小膠質(zhì)細(xì)胞的自噬與凋亡。自噬過度能夠加重神經(jīng)細(xì)胞的損傷，3-甲基腺嘌呤(MA)是一種自噬抑制劑，能夠加速神經(jīng)功能的恢復(fù)并減小梗死灶的面積；也有學(xué)者證實(shí)使用含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)抑制劑(一種廣譜的抗凋亡藥物)治療減輕腦缺血所致腦損傷程度卻相當(dāng)有限〔10〕，于是人們把目光逐漸轉(zhuǎn)向了自噬。自噬是哺乳動物中自身降解清除、細(xì)胞分化重建及調(diào)節(jié)自身穩(wěn)態(tài)的重要手段，在自噬的過程中有眾多的基因參與了自噬的關(guān)鍵過程，其中作為ATG6同系物之一的Beclin-1目前是檢測自噬活動的標(biāo)記蛋白〔11〕，Beclin-1可以調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的表達(dá)而參與自噬。本研究提示補(bǔ)陽還五湯能夠調(diào)控HIF-1α表達(dá)進(jìn)而降低Beclin-1蛋白，抑制細(xì)胞的自噬。SDF-1α亞型高表達(dá)在腦和骨髓等器官中；CXCR4為SDF-1的G蛋白耦聯(lián)特異性受體，與SDF-1α特異結(jié)合后形成SDF-1α/CXCR4軸可以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等。SDF-1α/CXCR4軸可調(diào)控血管生成，增加缺氧耐力等機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮修復(fù)神經(jīng)和腦保護(hù)作用〔12，13〕，故SDF-1α/CXCR4軸亦可能對細(xì)胞自噬狀態(tài)產(chǎn)生調(diào)控。

綜上所述，補(bǔ)陽還五湯對腦出血大鼠腦組織具有保護(hù)作用，其機(jī)制與HIF-1α調(diào)控SDF-1α/CXCR4軸抑制細(xì)胞自噬有關(guān)。