基于HIF-VEGF-Notch通路探討通脈活血湯對局灶性腦缺血再灌注大鼠的保護作用

李慧 李丹丹 吳珠 朱麗朋 李和教 王源江

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1藥劑科，海南 ?？?570102；2針灸科；3神經(jīng)內(nèi)科)

局灶性腦缺血再灌注損傷(FCIRI)是顱腦機械性、溶栓性和手術(shù)性創(chuàng)傷引起的主要并發(fā)癥。相關(guān)主要非介入治療方法往往是針對急性期的血液循環(huán)障礙和神經(jīng)元毒性而采取的溶栓、抗炎抗氧化和減輕腦血腫水腫等措施控制繼發(fā)性腦損傷〔1〕。神經(jīng)元受損是導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙的根本原因，而促進神經(jīng)元和相關(guān)營養(yǎng)細胞再生修復(fù)才是恢復(fù)神經(jīng)功能的關(guān)鍵所在。向病灶補充內(nèi)源性或外源性神經(jīng)干細胞(NSCs)能夠幫助神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞等相關(guān)營養(yǎng)細胞再生修復(fù)。鐘波等〔2〕向大鼠腦缺血部位移植NSCs取得較好治療效果。姜英虹等〔3〕研究表明，許多中藥制劑可通過不同的信號通路和途徑調(diào)節(jié)NSCs增殖分化。周勝強等〔4〕研究表明補陽還五湯能促進大鼠NSCs增殖。通脈活血湯與補陽還五湯配方相似，其中丹參有類似作用，且兩者兼具補氣活血通絡(luò)的功效〔5〕。因此驗證通脈活血湯是否有調(diào)控NSCs增殖分化作用，對該藥的臨床開發(fā)有一定指導(dǎo)意義。本研究以雄性SD大鼠為研究對象，線栓法構(gòu)建大鼠腦中動脈阻塞(MCAO)模型模擬FCIRI，腹膜下注射通脈活血湯和低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α轉(zhuǎn)錄抑制劑(YC-1)干預(yù)治療，通過觀察大鼠神經(jīng)功能狀況、組織學(xué)鑒定NSCs增殖分化情況和檢測HIF-血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-Notch各節(jié)點水平，探討通脈活血湯對FCIRI大鼠的神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性清潔級SD大鼠54只，4～5月齡，體重為(230±20)g，購自海南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(瓊)2017-0008，實驗動物使用許可證號：SYXK(瓊)2017-0046，動物質(zhì)量合格證號：20180169，鼠房模擬晝夜交替(12 h/12 h)，溫度(23±2)℃，相對濕度范圍為(55±15)%。給予充足的食物和清潔的飲水，定期更換墊料保持鼠箱干燥衛(wèi)生。

1.2藥品與試劑 曲拉通X-100(Triton-X-100)、HIF-1α轉(zhuǎn)錄抑制劑(YC-1)均購自美國Sigma-Aldrich公司，批號分別為T9284、Y1027；兔抗Sox2多克隆抗體、雞抗GFAP多克隆抗體、羊抗兔IgG H&L (Allophycocyanin)預(yù)吸附二抗、羊抗雞IgG H&L(Cy3?)預(yù)吸附二抗、兔抗HIF-1α單克隆抗體、大鼠VEGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、兔抗activated Notch1多隆抗體和兔抗β-actin單克隆抗體均購自英國Abcam公司，批號分別為ab97959、ab4674、ab130805、ab97145、ab179483、ab100786、ab8925、ab8227；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，批號BA1054。

1.3主要儀器 JR-30型恒溫鼠臺購自成都泰盟軟件有限公司；CM1950型冰凍切片機購自德國徠卡公司；CKX53型倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；PHOMO型酶標儀購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；大鼠用腦立體定位儀、MCAO用線栓、大鼠腦模具購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；LHZW001蠕動泵購自惠州市聯(lián)合眾為科技有限公司；eBlot?L1電轉(zhuǎn)膜儀購于南京金斯瑞生物科技有限公司；LightCycler?480 Ⅱ PCR儀購自瑞士羅氏公司。

1.4實驗方法

1.4.1通脈活血湯配制 采用三九制藥生產(chǎn)的免煎飲片來配制通脈活血湯。配方：當(dāng)歸10 g、赤芍8 g、川芎8 g、紅花8 g、丹參10 g、元參8 g、地龍10 g、全蝎4 g、雞血藤10 g、甘草 4 g。以上藥物來自海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥房，所有藥材經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院李和教副主任藥師鑒定。將以上單味藥免煎飲片用分析天平稱取混合后溶解于1 000 ml 5%葡萄糖溶液中，配制成有效成分80 mg/ml藥液。200 ml帶有魯爾接頭的無菌注射器連接濾菌器對配制好的藥液進行過濾分裝，4℃保存，用于腹膜下注射給藥。

1.4.2動物分組與給藥 將54只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、抑制劑組〔2.5 mg/(kg·d)〕、通脈活血湯低劑量組〔20 mg/(kg·d)〕、通脈活血湯中劑量組〔40 mg/(kg·d)〕和通脈活血湯高劑量組〔80 mg/(kg·d)〕，每組各9只。大鼠造模成功后即開始藥物干預(yù)，每天稱重后按照體重給藥。抑制劑組腹膜下注射2.5 mg/kg YC-1/二甲基亞砜溶液，1次/d〔6〕，通脈活血湯低、中、高劑量組按照20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg腹膜下注射通脈活血湯藥液1次/d。假手術(shù)組和模型組注射2.5 ml 5%葡萄糖注射液，1次/d。連續(xù)給藥1 w后進行后續(xù)實驗。

1.4.3動物建模 線栓法構(gòu)建大鼠MCAO模型〔7〕，模擬局灶性腦缺血。尾靜脈注射3%戊巴比妥鈉(25 mg/kg)麻醉大鼠，再將大鼠仰臥置于恒溫鼠臺上，使肛溫保持在(37±1)℃。剪開大鼠頸部皮膚，玻璃分針挑起右側(cè)頸動脈；以頸總動脈分支點為中心，對大鼠右側(cè)總頸動脈和頸外動脈進行近中心點結(jié)扎；線栓沿大鼠頸內(nèi)動脈推進，待有明顯阻力時停止推進，此時手術(shù)線已經(jīng)越過腦中動脈分支點，實現(xiàn)MCAO。保持2 h后撤出栓線，在近中心點位置結(jié)扎頸內(nèi)動脈，縫合傷口，完成造模。假手術(shù)組只在近中心點位置結(jié)扎頸內(nèi)動脈，不進行MCAO。

1.4.4大鼠神經(jīng)功能評分 藥物干預(yù)結(jié)束后首先進行神經(jīng)功能評分測試。評分采用改進自5分法〔8〕：0≤分數(shù)<1為正常狀態(tài)；1≤分數(shù)<2為輕度損傷，拽尾拖曳反抗時左前肢伸展無力；2≤分數(shù)<3為中度損傷，左側(cè)跛行無法或直行障礙；3≤分數(shù)<4為重度損傷，站立不穩(wěn)易向左側(cè)傾倒；4≤分數(shù)<5為嚴重損傷，不能行走，意識不清醒。

1.4.5樣本采集 對大鼠進行神經(jīng)功能評分后，將大鼠麻醉后固定在腦立體定位儀上，剪開寰枕處皮膚，灰色頭皮針穿入枕大池，微量進樣器抽取腦脊液100 μl，注入EP管-20℃凍存用于ELISA檢測。采集后回輸100 μl生理鹽水用于維持顱內(nèi)壓，縫合傷口，用于下一步采集。然后各組隨機取3只大鼠用于免疫組織化學(xué)染色，其余用于RT-PCR和Western印跡檢測。

用于免疫組化的大鼠麻醉后仰臥用解剖針固定四肢于蠟盤上，沿體中線剪開胸腹腔，眼科剪剪開心包膜暴露出心臟。將灌流針穿入左心室，同時剪開靠近右心房的體靜脈，先以40 ml/min流速灌入200 ml 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH為7.4)，再以20 ml/min灌入200 ml 4℃ 4%多聚甲醛溶液。開顱取腦，借助腦模具冠狀截取A 1.25至A 1.5之間右腦組織塊，置于4%多聚甲醛4℃固定24 h，0.02 mol/L PBS漂洗3次，沖掉固定液以防止脫片。最后4℃下依次在12.5%和25.0%的蔗糖溶液中沉糖脫水，以備切片。

用于RT-PCR和Western印跡檢測的大鼠，斷頸處死取右腦側(cè)端腦進行低溫勻漿，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.6免疫熒光雙重標記染色檢測大鼠腦組織中Sox2和GFAP染色細胞數(shù) 從蔗糖溶液中取出腦組織塊進行冠狀冰凍切片(樣品頭-22℃，切片室-19℃，切片厚度30 μm)。將切片用PBS沖洗后使用0.1%曲拉通打孔，PBS沖洗，5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30 min，甩掉封閉液，加一抗(稀釋比例均為1∶100)4℃過夜后，加PBS在脫色搖床上洗掉未附著一抗，滴加熒光二抗孵育1 h，PBS洗去未附著二抗，然后用抗淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下隨機選擇3個視場拍照。采用ImageJ15.1軟件進行分析。將圖像變?yōu)?6位灰度圖像后，對發(fā)熒光部分進行閾值填充，使用細胞計數(shù)工具對染色細胞進行計數(shù)。

1.4.7RT-PCR檢測大鼠腦組織HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平 取0.5 g組織勻漿，加入核酸提取液富集總RNA，260/280法確定RNA豐度符合PCR要求后，使用cDNA試劑盒在RT-PCR儀上合成cDNA。參比為GADPH，采用2-ΔΔCq法計算mRNA含量。引物合成服務(wù)由上海生工生物工程股份有限公司提供。HIF-1：正向序列：5′-TGA ACA TCA AGT CAG CAA CG-3′,反向序列：5′-CAC AAA TCA GCA CCA AGC AC-3′;VEGF：正向序列：5′-GAA GCT CAT CTC TCC TAT GTG CTG GC-3′,反向序列：5′-GAA GCT CAT CTC TCC TAT GTG CTG GC-3′;Notch1：正向序列：5′-GAC CGT GTG GCT TCC TTC TA-3′,反向序列：5′-GTT GGT GTC GCA GTT GGA G-3′;GADPH：正向序列：5′-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3′,反向序列：5′-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3′。

1.4.8ELISA測定大鼠腦脊液中VEGF含量 將腦脊液樣本和ELISA試劑盒室溫平衡20 min。校準品復(fù)孔。參考說明書，加注樣品稀釋液后每孔加入校準品或樣品25 μm，微孔板振蕩器快速振蕩2～3 s貼封板膜37℃溫箱孵育，洗板3次，拍干后加入酶標抗體孵育，再洗板拍干，加入TMB室溫顯色5 min后加入終止液終止顯色。顯色過程控制本底。酶標儀450 nm下測各孔吸光度。獲得標準曲線后，反推樣本VEGF濃度。

1.4.9Western印跡檢測大鼠腦組織中HIF-1α、Notch1蛋白表達量 向1.4.5剩余組織勻漿中加入蛋白提取液，冰塊上靜置1 h。4℃ 8 000 r/min離心15 min，BCA試劑盒檢測蛋白富集程度。之后進行電泳轉(zhuǎn)膜。BSA封閉后，加入一抗二抗孵育。ECL顯色后，使用凝膠成像儀拍照，分析各組蛋白表達量。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS2.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1大鼠神經(jīng)功能評分 與假手術(shù)組神經(jīng)功能評分〔(0.00±0.00)分〕相比，模型組〔(4.32±0.13)分〕顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組〔(3.44±0.27)分〕、通脈活血湯低、中、高劑量組〔(3.92±0.13)、(3.75±0.18)、(3.51±0.20)分〕神經(jīng)功能評分顯著降低(P<0.05)，且通脈活血湯各組隨著劑量的升高神經(jīng)功能評分依次降低(P<0.05)；與抑制劑組相比，通脈活血湯低、中劑量組神經(jīng)功能評分顯著升高(P<0.05)，通脈活血湯高劑量組神經(jīng)功能評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2免疫熒光雙重標記染色檢測大鼠腦組織中Sox2、GFAP染色細胞數(shù) 與假手術(shù)組相比，模型組Sox2、GFAP染色細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組、通脈活血湯低、中、高劑量組Sox2、GFAP染色細胞數(shù)顯著升高(P<0.05)，且通脈活血湯各組隨著劑量的升高Sox2、GFAP染色細胞數(shù)依次升高(P<0.05)；與抑制劑組相比，通脈活血湯低、中劑量組Sox2、GFAP染色細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，通脈活血湯高劑量組Sox2、GFAP染色細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1，表1。

Sox2染色細胞在630 nm激發(fā)光下發(fā)出紅色熒光，GFAP染色(Cy3)細胞在552 nm激發(fā)光下發(fā)綠色熒光，Sox2與GFAP重疊發(fā)黃色熒光圖1 各組腦組織Sox2、GFAP免疫組化染色(×50)

表1 各組腦組織Sox2、GFAP染色細胞數(shù)

2.3RT-PCR檢測大鼠腦組織中HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平 與假手術(shù)組相比，模型組腦組織HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組、通脈活血湯低、中、高劑量組腦組織HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平顯著降低(P<0.05)，且通脈活血湯各組隨著劑量的升高HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平依次降低(P<0.05)；與抑制劑組相比，通脈活血湯低、中劑量組腦組織HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，通脈活血湯高劑量組腦組織HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組腦組織HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA及HIF-1α、Notch1蛋白表達水平比較

2.4ELISA檢測腦脊液VEGF水平 與假手術(shù)組腦脊液中VEGF水平〔(5.21±0.21)pg/ml〕相比，模型組〔(15.15±3.14)pg/ml〕顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組〔(8.25±1.31)pg/ml〕、通脈活血湯低、中、高劑量組〔(12.45±2.12)、(9.52±1.21)、(7.44±1.18)pg/ml〕顯著降低(P<0.05)，且通脈活血湯各組隨著劑量的升高腦脊液中VEGF水平依次降低(P<0.05)；與抑制劑組相比，通脈活血湯低、中劑量組腦脊液中VEGF水平顯著升高(P<0.05)，通脈活血湯高劑量組腦脊液中VEGF水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5Western印跡檢測大鼠腦組織中HIF-1α、Notch1蛋白水平 與假手術(shù)組相比，模型組HIF-1α、Notch1蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組、通脈活血湯低、中、高劑量組HIF-1α、Notch1蛋白水平顯著降低(P<0.05)，且通脈活血湯各組隨著劑量的升高HIF-1α、Notch1蛋白水平依次降低(P<0.05)；與抑制劑組相比，通脈活血湯低、中劑量組HIF-1α、Notch1蛋白水平顯著升高(P<0.05)，通脈活血湯高劑量組HIF-1α、Notch1蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖2。

1～6:假手術(shù)組，模型組，抑制劑組，通脈活血湯低劑量組，通脈活血湯中劑量組，通脈活血湯高劑量組圖2 各組腦組織HIF-1α、Notch1 Western印跡條帶比較

3 討 論

HIF-1是組織應(yīng)對低氧最先表達的一種因子，由α和β兩種亞基組成，其中前者決定HIF-1轉(zhuǎn)錄活性。HIF-1α能夠與VEGF分子中的缺氧反應(yīng)部件特異性結(jié)合，增加其穩(wěn)定性，從而正向調(diào)節(jié)VEGF的轉(zhuǎn)錄表達。Notch蛋白家族是一類進化上高度保守跨膜蛋白。VEGF與其受體結(jié)合后，引起Notch信號通路配體的表達〔9〕。Notch發(fā)揮作用時，與胞外相應(yīng)配體結(jié)合后會水解釋放胞內(nèi)部分，Notch胞內(nèi)部分能夠進入細胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用，影響細胞形態(tài)發(fā)生。腦缺血再灌注等極端條件下，組織細胞中HIF-1α病理性高表達從而引起VEGF和Notch1的異常升高，這種病理性的升高可能并不利于神經(jīng)功能的保護。Sun等〔10〕研究指出miRNA-210激活HIF-1α-VEGF途徑會導(dǎo)致大鼠神經(jīng)元細胞凋亡。Wang等〔11〕指出HIF-1α升高可通過HIF-VEGF途徑影響水通道蛋白4活性從而加重腦水腫和血腦屏障破壞。有研究指出HIF-1α病理性升高能影響核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB炎癥通路從而加重細胞凋亡〔12〕。促進VEGF升高雖然有利于新血管生成、對腦血管內(nèi)皮保護作用，但VEGF病理性高表達容易誘導(dǎo)生成不成熟、易滲漏的微血管，其滲出物反而會進一步加重周圍正常神經(jīng)細胞的炎癥反應(yīng)〔13,14〕。Herrick等〔15〕研究表明Notch1高表達會使NSCs保持休眠。Contreras等〔16〕研究表示果蠅視葉NSCs中Notch1異常高表達會使其向祖細胞轉(zhuǎn)化。急性期減弱Notch信號通路能促進NSCs增殖、向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞等分化，從而有利于神經(jīng)修復(fù)〔17〕。Hao等〔18〕指出在腦卒中亞急性期抑制Notch1可促進內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生和軸突重組。在一定程度上調(diào)Notch有利于NSCs增殖，但Notch1病理性升高可能會使Notch趨于休眠保護狀態(tài)，不利于NSCs增殖。因此在下調(diào)病理狀態(tài)下的HIF-VEGF-Notch通路可誘導(dǎo)NSCs增殖分化，從而起到神經(jīng)保護的作用。Sox2是NSCs特異性標志物，而GFAP則在星形膠質(zhì)細胞和NSCs細胞中表達。因此可以通過Sox2和GFAP熒光雙標染色來觀察大鼠腦組織中NSCs增殖和分化情況〔19〕。中醫(yī)認為FCIRI屬于“風(fēng)、火、痰、瘀”，血瘀內(nèi)停，痹阻腦絡(luò)，腦失所養(yǎng)，筋脈失于濡養(yǎng)而發(fā)病。本研究所用通脈活血湯中當(dāng)歸、丹參、川芎、雞血能夠補血化瘀、行氣通滯的功效，其余各藥也均有通經(jīng)活絡(luò)的作用，對癥下藥以解諸癥。

本研究顯示，抑制劑組神經(jīng)功能評分、腦組織中Notch1、VEGF和HIF-1 mRNA水平、腦脊液中VEGF水平、腦組織中HIF-1α和Notch1蛋白水平比模型組和通脈活血湯低、中劑量組低，這可能是因為YC-1特異性地抑制HIF-1α，從而下調(diào)VEGF和Notch1水平。Na等〔20〕研究結(jié)果表明YC-1有抑制反應(yīng)性膠質(zhì)細胞和神經(jīng)保護的作用。Shen等〔21〕也指出YC-1通過抑制HIF-1α與MMP-2和VEGF相互作用，降低血腦屏障損傷。本研究結(jié)果說明高劑量的通脈活血湯有YC-1樣作用，推測通脈活血湯也可能通過其他調(diào)節(jié)通路進一步促進NSCs增殖分化。

綜上，在MCAO大鼠治療過程中，通脈活血湯可能通過影響HIF-VEGF-Notch通路，改善病理性NSCs休眠，來促進NSCs增殖分化，從而起到神經(jīng)保護的作用。實驗設(shè)計沒有對HIF-VEGF-Notch下游Notch1信號途徑的多樣性展開進一步探討是本研究的不足之處。