尿液miRNA 檢測在膀胱癌診斷中的價(jià)值

楊碧鋒 袁霞妹 張文寶

(浙江金華廣福腫瘤醫(yī)院，浙江 金華 321000)

膀胱癌是泌尿系最常見的腫瘤之一，其死亡率排在泌尿系腫瘤的第二位〔1〕。常用于膀胱腫瘤相關(guān)檢查的項(xiàng)目有膀胱鏡檢查、盆腔影像學(xué)、血清腫瘤標(biāo)志物、尿沉渣脫落細(xì)胞檢查等，但這些方法存在侵入性、操作難、敏感性和特異性低等缺點(diǎn)〔1〕，因而臨床上需要尋找更有價(jià)值的診斷標(biāo)志物。miRNA是一種非編碼的單鏈RNA，對細(xì)胞轉(zhuǎn)移、凋亡、增殖和遷移等功能有顯著影響，對人類1/3的基因起調(diào)控作用〔2〕，其異常表達(dá)在許多腫瘤中(包括膀胱癌)已被證實(shí)〔3，4〕。本研究基于以往基因芯片數(shù)據(jù)分析，膀胱癌高通量測序結(jié)果及對膀胱癌miRNA的研究，選擇表達(dá)差異顯著且穩(wěn)定性、特異性佳的miRNA，探索其在膀胱癌診斷中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1研究對象 選取2016年1月至2018年12月浙江金華廣福腫瘤醫(yī)院收治的接受膀胱癌手術(shù)的患者30例為病例組，收集患者的臨床資料、術(shù)前尿液、術(shù)后癌組織和癌旁正常組織病理標(biāo)本。所有患者經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)或膀胱全切術(shù)，術(shù)中和術(shù)后病理均明確診斷為膀胱癌。男23例，女7例，平均年齡(55.38±7.29)歲，T1期21例，T2期6例，T3期3例，排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前曾接受過化療、放療或免疫治療者；②合并有其他腫瘤患者；③合并有泌尿系其他疾病患者；④合并有其他重要臟器嚴(yán)重疾病者；⑤膀胱癌再發(fā)者。入選同期30例健康體檢者(對照組)的尿液。對照組男20例，女10例，平均年齡(56.24±7.34)歲。兩組年齡、性別等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)會批準(zhǔn)，所有研究對象簽署知情同意書并自愿參加。

1.2標(biāo)本采集 術(shù)前膀胱癌患者及健康體檢者均留取清晨尿液樣本15 ml，置于-80℃冰箱中保存待檢，收集尿液之前3 d患者未進(jìn)行任何侵入性操作(包括膀胱鏡、尿道沖洗等)。術(shù)中標(biāo)本離體后采集新鮮膀胱癌組織標(biāo)本及相應(yīng)正常黏膜組織標(biāo)本，所有新鮮標(biāo)本立即放入液氮中凍存30 min后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱中保存待檢。

1.3檢測方法 根據(jù)既往膀胱癌高通量測序及基因芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果及文獻(xiàn)對于膀胱癌miRNA的研究報(bào)道，選擇以下10個(gè)miRNA進(jìn)行研究：miRNA-20a、miRNA-129、miRNA-21、miRNA-133a、miRNA-8085、miRNA-137、miRNA-143、miRNA-96、miRNA-451及miRNA-212。從美國國家生物技術(shù)信息中心官方網(wǎng)站上查詢相應(yīng)miRNA序列，委托北京天根生物有限公司合成所需引物。使用天根miRcute miRNA熒光定量檢測試驗(yàn)盒(FP401)進(jìn)行熒光定量PCR，嚴(yán)格根據(jù)說明書進(jìn)行操作，以U6作為內(nèi)參物，每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)采用2-△ct法檢測基因表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，繪制受試者工作特征(ROC)曲線。

2 結(jié) 果

2.1癌組織和癌旁組織中各miRNA的表達(dá)差異 膀胱癌患者癌組織中的miRNA-20a和miRNA-21相對表達(dá)量均顯著高于癌旁正常組織，miRNA-129、miRNA-133a、miRNA8085、miRNA-451及miRNA-143相對表達(dá)量均顯著低于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

2.2膀胱癌患者尿液樣本與健康體檢人群尿液標(biāo)本中各miRNA表達(dá)差異比較 膀胱癌患者尿液中miRNA-21的相對表達(dá)量顯著高于健康體檢人群，miRNA-129、miRNA-133a及miRNA-143的相對表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 癌組織與癌旁正常組織及膀胱癌患者與體檢者尿液中各miRNA表達(dá)

2.3各尿液miRNA對膀胱癌的診斷價(jià)值 尿液miRNA-129、miRNA-21、miRNA-133a及miRNA-143的AUC較大。見表2。

表2 各尿液miRNA對膀胱癌的診斷價(jià)值

2.4尿液miRNA兩兩組合對膀胱癌的診斷價(jià)值 尿液miRNA-129、miRNA-21、miRNA-133a及miRNA-143等兩兩組合后AUC均>0.9，其中miRNA-133a+miRNA-143組合的AUC達(dá)到0.994，敏感性和特異性是0.975、0.925。見表3。

表3 miRNA-129、miRNA-21、miRNA-133a及miRNA-143兩兩組合對膀胱癌的診斷價(jià)值

3 討 論

臨床膀胱癌的診斷幾乎全部依賴于侵入性的膀胱鏡檢查和組織病理學(xué)。但是，膀胱鏡檢查有創(chuàng)傷性，且費(fèi)用昂貴，并不適用于大規(guī)模人群的篩查。盆腔影像學(xué)檢查也不能發(fā)現(xiàn)早期的膀胱癌。許多膀胱癌的腫瘤標(biāo)志物(如：纖維連接蛋白、膀胱腫瘤抗原)敏感性和特異性均差強(qiáng)人意。尿沉渣細(xì)胞中的RNA雖然主要來源于腫瘤細(xì)胞，但容易受到各種因素的影響〔5〕，因此也不適用于膀胱癌的診斷。尿上清液中的RNA來源于尿液外泌體和循環(huán)中的miRNA，因其受到RNA酶的影響小，所以其理化性質(zhì)穩(wěn)定、成分穩(wěn)定〔6，7〕。Yamada等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)在尿路上皮細(xì)胞癌患者尿液中miRNA-96和miRNA-183的表達(dá)水平顯著高于健康體檢者，尿路脫落細(xì)胞中miRNA-96的表達(dá)水平與尿路上皮細(xì)胞癌的臨床特性高度相關(guān)。Shi等〔7〕研究也有類似發(fā)現(xiàn)。因此尿液miRNA可作為膀胱癌診斷的標(biāo)志物。

本研究研究對象的尿液、膀胱癌組織及癌旁組織中均檢測出上述miRNA，提示尿液中miRNA作為膀胱癌腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行診斷是可行的。與以往的相關(guān)研究報(bào)道有一定的相似性〔9，10〕。另外在本研究中還發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者尿液中miRNA-21的相對表達(dá)量高于健康體檢人群，而miRNA-129、miRNA-133a及miRNA-143的相對表達(dá)量則低于健康體檢人群(均P<0.05)，這與國內(nèi)外的某些研究結(jié)果相似〔11，12〕。既往研究表明〔13〕，單個(gè)miRNA基因檢測對疾病診斷的敏感性較低，而聯(lián)合檢測多次miRNA基因可顯著提高檢測的陽性率。

綜上，聯(lián)合檢測miRNA-129和miRNA-143的相對表達(dá)量對膀胱癌具有較好的診斷價(jià)值。