蔗糖轉運蛋白OsSUT5在水稻花粉發(fā)育及結實中的作用

張雅文，包淑慧，唐振家，王小文,2，楊芳，張德春，胡一兵

蔗糖轉運蛋白OsSUT5在水稻花粉發(fā)育及結實中的作用

張雅文1，包淑慧1，唐振家1，王小文1,2，楊芳3，張德春4，胡一兵

1南京農業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，南京 210095；2南京農業(yè)大學園藝學院，南京 210095；3武漢大學生命科學學院雜交水稻國家重點實驗室，武漢 430072；4三峽大學生物技術研究中心，湖北宜昌 443002

【】蔗糖是植物體內光合產物運輸的主要形式。蔗糖-質子同向運輸蛋白（sucrose transporter/sucrose carrier，SUT/SUC）在植物細胞之間的蔗糖跨膜運輸以及植物組織和器官之間的蔗糖分配中具有重要作用。水稻SUT家族共有5個成員。已有研究表明，敲除、、、對水稻的生長發(fā)育產生顯著影響，說明這些基因不可替代。然而，OsSUT5的功能還未見報道。闡明OsSUT5在水稻生長發(fā)育中的作用，將為全面了解SUT蛋白在模式植物水稻中的生理功能提供新的依據。通過對水稻的時空表達特性進行實時熒光定量PCR分析，同時利用的推測啟動子驅動在水稻體內表達，獲得其基因編碼蛋白的組織定位信息，以及在煙草葉片表皮細胞內進行OsSUT5-GFP融合蛋白瞬時表達，對蛋白進行亞細胞定位，比較基因編輯技術（CRISPR-Cas9）創(chuàng)制的不同純合突變株系與野生型對照水稻的形態(tài)和生理特征，獲得OsSUT5的功能信息。轉錄水平上，在水稻莖、葉、花序和穎果中均有表達，并且該基因編碼蛋白在營養(yǎng)器官中的表達集中于維管組織。在生殖器官中，的表達主要位于花藥及發(fā)育的穎果內。該基因編碼蛋白在水稻發(fā)育的穎果特別是盾片和胚根鞘中高表達。煙草葉片表皮細胞內的瞬時表達顯示OsSUT5-GFP融合蛋白定位于細胞質膜。與野生型水稻相比，3個純合突變株系均表現(xiàn)為花粉活性以及離體萌發(fā)率明顯降低。與此相吻合的是，突變株系未授粉的小穗比例相對于野生型顯著增加，同時突變株系結實率顯著下降。通過對突變株系穎果的觀察和比較顯示，突變體水稻穎果的堊白相對于野生型明顯增多，其穎果長度相對于野生型對照也有一定程度的增加，但統(tǒng)計結果表明突變體水稻的千粒重與野生型無顯著區(qū)別。OsSUT5在水稻花粉發(fā)育甚至受精過程中可能發(fā)揮重要作用；敲除對水稻的結實率、籽粒的形態(tài)和品質有明顯影響。推斷OsSUT5在水稻開花結實中的作用（包括對花粉活性和穎果內胚乳發(fā)育的影響）與其蔗糖運輸功能密切相關。

水稻；OsSUT5；CRISPR-Cas9；花粉萌發(fā)；結實率；堊白

0 引言

【研究意義】籽粒是水稻的可食用部分，其中淀粉約占籽粒重量的90%。淀粉的合成源于植物綠色組織光合作用產生的葡萄糖。葡萄糖在細胞質中轉化為蔗糖作為光合產物的主要形式運輸到“庫”器官[1-2]。植物體內合成碳水化合物等有機物的器官如葉片，稱為“源”器官，而接受有機物的器官稱為“庫”器官，包括根、莖、花、果實和種子等[3-4]。在水稻生殖生長期間，籽粒是最重要的庫器官。蔗糖在從源到庫的運輸以及分配中存在2種途徑，即依賴胞間連絲的共質體途徑和依賴跨膜載體運輸的質外體途徑[5]。蔗糖-質子同向運輸蛋白（SUT（C））是質外體運輸途徑的重要成員?！厩叭搜芯窟M展】蔗糖-質子同向運輸蛋白（sucrose transporters or sucrose carrier，SUTs/SUCs）屬于主要易化子超家族（major facilitator superfamily，MFS）的成員[6]。它們存在于植物中，并且與細菌、真菌和動物的己糖轉運蛋白親緣關系較遠[7]。自1992年從菠菜中鑒定出第一個SUT成員[8]，此后很多植物的SUT基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)和報道[9-14]。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，植物SUT蛋白可分為3、4或5個亞族[5,10,15]。在5個亞族的分類體系中，SUT1亞族為雙子葉植物特有；SUT2和SUT4亞族為單、雙子葉植物所共有；SUT3和SUT5亞族則為單子葉植物所特有[15]。對SUT家族部分基因功能研究發(fā)現(xiàn)，它們不僅參與植物體內蔗糖的運輸和分配，也與植物的生長發(fā)育密切相關，比如影響花粉、果實的發(fā)育，參與植株的生長和乙烯的生物合成等過程[16-19]。水稻SUT家族共有5個成員[10]。其中在水稻生長發(fā)育中所承擔的功能已經引起了研究人員的廣泛興趣，而且針對這個基因生理功能的研究報道還在不斷地擴展和深入[20-27]。敲除引起水稻的株高、分蘗數和千粒重顯著降低[28]。最近，李孟珠等[29]通過CRISPR-Cas9敲除導致水稻株高降低，分蘗增加和產量降低等表型。岳萌萌[30]的研究也得到了類似的結果。對擬南芥和水稻SUT基因的結構和組成分析顯示，它們都由多個外顯子組成，部分SUT基因存在可變剪切。水稻由13個外顯子構成。目前只發(fā)現(xiàn)它的一個轉錄本。2012年一項在非洲爪蟾卵母細胞中的研究顯示，OsSUT5和OsSUT1一樣具有蔗糖運輸能力，并且顯示OsSUT5較OsSUT1具有更高的底物親和性（0.5=2.32 mmol·L-1，pH=5.6）、更低的底物特異性和低pH依賴的特點[31]。擬南芥中，編碼一個胚乳特異表達的蔗糖運輸蛋白，突變導致擬南芥胚發(fā)育輕微延遲[32]，而且有研究顯示AtSUC5除了運輸蔗糖，還能運輸生物素[33]。水稻中一些關于OsSUT5的研究表明，反義抑制表達導致秈稻品種明恢盾片膨大以及愈傷組織誘導率和增值率顯著下降[34]；同時還引起穎果直鏈淀粉含量變高，堊白度升高[35]。【本研究切入點】盡管上述工作為闡明OsSUT5的生理功能提供了重要線索，但有關該基因的系統(tǒng)研究還未見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究旨在通過基因編輯技術獲得突變體株系，比較它們與野生型水稻的表型，明確其生理功能，結合基因在轉錄水平的表達模式及其在蛋白水平的組織定位鑒定OsSUT5的功能，為闡明水稻體內蔗糖運輸蛋白OsSUT5的生理功能及其作用機制提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗水稻品種為日本晴（L. ssp.cv. Nipponbare），2018—2020年種植于南京農業(yè)大學牌樓實驗基地。采用15 cm×20 cm的株距、行距，自然條件下生長。大腸桿菌菌株DH5α、農桿菌菌株EHA105，以及試驗所用亞細胞定位載體pSAT6A- EGFP-N1、pSAT6A-EGFP-C1、pRCS2和組織定位載體pCAMBIA1300（GUS）、pCAMBIA1300（GFP）均由南京農業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院植物營養(yǎng)實驗室保存。

1.2 OsSUT5的表達模式分析

1.2.1轉錄水平表達豐度的分析 采集水稻幼苗期的根系、葉片和成熟期的莖、葉鞘、孕穗期的花序以及開花后3、4、5、6、7和12 d的穎果，在液氮中冷凍、研磨，利用Trizol提取各部位的總RNA，反轉錄生成cDNA。根據（）的mRNA序列設計qPCR-F/R引物（電子附表1），以為內參基因，通過qRT-PCR檢測在水稻不同組織部位的表達水平，設3個生物學重復。用2-ΔΔCT法[36]計算的相對表達量。采用Microsoft Excel進行數據統(tǒng)計及顯著性分析。

1.2.2 OsSUT5-GFP融合蛋白的亞細胞定位載體構建及其在煙草中的瞬時表達 根據的cDNA全長1 608 bp設計引物NF/R、CF/R（電子附表1）。以水稻穎花總RNA逆轉錄獲得的cDNA為模板，使用高保真DNA聚合酶Prime STAR Max Premix（2×）進行PCR擴增反應。擴增產物分別與中間載體pSAT6A- EGFP-C1、pSAT6A-EGFP-N1通過Ⅰ和HⅠ線性化后進行無縫克隆連接。連接產物轉化大腸桿菌，挑取陽性菌落培養(yǎng)、提取質粒，測序正確后命名為SUT5-C和SUT5-N。然后以SUT5-C和SUT5-N質粒為模板設計通用無縫克隆引物TYF/TYR（電子附表1）進行PCR擴增。擴增產物連接進入經Ⅰ線性化的目的載體pRCS2-ocs-nptⅡ。完成構建的表達質粒經電擊轉化根癌農桿菌EHA105。挑取農桿菌單克隆接種到含有相應抗生素的YFP液體培養(yǎng)基中，待菌液A260≈0.8時收集菌體。將上述菌體用Induce medium調整濃度至A260值為0.1—0.2，用不加針頭的注射器將菌液注射到6—8周齡大小的本氏煙草（）葉片中。暗培養(yǎng)2.5 d后，取其葉片在激光共聚焦顯微鏡（SP5，Leica）下觀察熒光信號。同時以膜蛋白OsSWEET11-GFP融合表達載體[37]和空載體轉化農桿菌侵染煙草葉片作為陽性對照和陰性對照。

1.2.3OsSUT5組織定位材料的構建 選取預測啟動子序列（其ATG上游2 005 bp片段），根據此序列設計兩端分別帶有HⅠ和Ⅰ酶切位點的引物ProOsSUT5-F/ProOsSUT5-R（電子附表1），以水稻基因組DNA為模板，用KOD-Plus-Ver.2（Toyobo）高保真酶進行擴增反應。選擇HⅠ和Ⅰ雙酶切質粒pCAMBIA1300，酶切完成后凝膠電泳回收，與經同樣雙酶切的預測啟動子擴增產物連接，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞。然后挑取陽性單克隆培養(yǎng)，提取質粒，測序正確后將質粒命名為1300-ProSUT5。將該質粒電擊轉化農桿菌EHA105感受態(tài)細胞。農桿菌陽性克隆液體培養(yǎng)后按常規(guī)方法侵染水稻愈傷組織，通過篩選、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)獲得轉基因組織定位材料的幼苗。幼苗經PCR擴增測序鑒定后在溫室及水稻試驗基地種植。

1.2.4突變體材料的構建 將登錄號輸入到Spacer數據庫（瞿禮家教授實驗室），按照Miao等[38]方法選擇位于第1、4、7外顯子上的序列為靶點（電子附表1）。分別在Spacer的正義鏈5′端加上GGCA，反義鏈5′端加上AAAC合成寡核苷酸鏈。3對Spacer寡核苷酸退火后分別與用Ⅰ單酶切pOs-sgRNA載體進行連接反應。連接產物轉化大腸桿菌，挑取陽性克隆培養(yǎng)，提取質粒。測序正確的質粒分別命名為sgRNA-OsSUT5-Spacer1、sgRNA-OsSUT5-Spacer2和sgRNA-OsSUT5-Spacer3。然后將它們分別與pH-Ubi-Cas9-7目的載體通過LR Clonase? II enzyme mix進行Gateway LR反應。反應產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，然后挑取陽性菌落培養(yǎng)提取質粒。質粒測序正確后分別命名為pOsSUT5-/1/ 2/3-Cas9。最后，將這些質粒分別轉化進入農桿菌，按常規(guī)程序侵染水稻愈傷組織獲得CRISPR-Cas9編輯的突變體材料。

1.2.5純合突變水稻株系的鑒定 通過CRISPR/ Cas9編輯獲得轉基因幼苗后，提取其基因組DNA。首先根據Cas9編碼序列設計引物Cas9-F/Cas9-R進行第一輪篩選鑒別轉基因陽性植株。然后分別在3個Spacer靶點序列兩端設計第二輪擴增引物（電子附表1）對陽性轉基因植株進行基因編輯效果的驗證。

1.2.6純合突變體水稻表型分析及數據處理 在奧林巴斯解剖鏡（Olympus MVX10BX51）下觀察OsSUT5組織定位材料的GUS染色結果?；ǚ廴旧约懊劝l(fā)結果在奧林巴斯顯微鏡（BX51）下觀察。日本晴野生型和純合突變體水稻結實后統(tǒng)計結實率、千粒種以及種子萌發(fā)率。樣品設3個生物學重復。采用Microsoft Excel進行數據統(tǒng)計及顯著性分析，柱狀圖代表的數據為平均值±標準偏差（SD）。

1.2.7 SUT（C）的系統(tǒng)發(fā)育分析 根據已發(fā)表的文章[5,10, 15,39-44]，通過NCBI收集SUT（C）基因編碼蛋白序列153個。將這些蛋白序列用Clustal Omega進行在線序列比對，然后在BioEdit中對序列進行剪切。選取其中保守度高的252個氨基酸做建樹分析。結果輸入MEGA-X，用鄰接法（NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育。Bootstrap=1 000。

2 結果

2.1 OsSUT5的表達模式分析

2.1.1主要在水稻的莖、葉、花序和穎果中表達 對水稻根、葉、莖、葉鞘、花序以及開花后3、4、5、6、7和12 d的穎果進行qRT-PCR檢測其表達豐度，從結果可以看出，在水稻的莖、葉、花序中表達較弱，而在穎果發(fā)育早期表達量較高（圖1）。這個結果與水稻基因芯片分析結果吻合（https:// ricexpro.dna.affrc.go.jp/GGEP/graph-view.php?featurenum=24366）。

2.1.2 OsSUT5的亞細胞定位 將預測啟動子啟動報告基因的表達載體轉入水稻愈傷組織，通過抗生素抗性篩選以及器官分化獲得轉基因幼苗。剪取幼苗的根、葉片以及在田間生長時期剪取莖、葉鞘、花器官和穎果部位進行GUS染色（圖2）。結果顯示，該基因表達蛋白在根、莖、葉、花和穎果的器官中均有表達。OsSUT5在水稻營養(yǎng)器官中的表達集中于維管束；生殖生長期間該蛋白在花藥及發(fā)育早期穎果的盾片和胚根鞘中表達強烈。

2.2 OsSUT5-GFP融合蛋白定位于細胞質膜上

為驗證OsSUT5的膜定位特征，構建OsSUT5-GFP融合蛋白表達載體并將該載體轉入農桿菌。通過農桿菌侵染煙草葉片表皮細胞進行瞬時表達分析。激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，與膜定位的陽性對照OsSWEET11-GFP融合蛋白一樣[33]，OsSUT5-GFP融合蛋白的熒光也定位在細胞質膜（圖3）。與此形成對比的是，轉化空載體的陰性對照煙草細胞中綠色熒光在細胞核和細胞膜都有分布。

圖1 OsSUT5表達的qRT-PCR分析

A：萌發(fā)3 d的幼根；B：苗期幼莖橫切面；C：孕穗期葉片；D：即將抽穗的小花；E：開花后9 d的穎果。F：開花后9 d穎果的胚。白色箭頭指示維管組織；紅色箭頭指示盾片；黃色箭頭指示胚根鞘。圖中標尺為1 mm

圖3 OsSUT5-GFP融合蛋白在煙草葉片表皮細胞中瞬時表達的亞細胞定位

2.3 OsSUT5突變體的表型分析

2.3.1 突變體材料的分子鑒定及田間表型分析 對CRISPR-Cas9編輯的水稻突變體材料進行基因組DNA提取、高保真DNA聚合酶擴增，測序鑒定后選取其中3個表型一致的株系、和作進一步分析。這3個株系的編輯位點以及在外顯子上的位置如圖4-C所示，株系Spacer1對應區(qū)域的第17位A和第18位G核苷酸之間，也就是PAM上游第3—4位核苷酸之間的Cas9核酸酶切割處，插入了一個腺嘌呤核苷酸A。株系Spacer2對應區(qū)域的第17位T和第18位C核苷酸之間插入1個胸腺嘧啶核苷酸T。株系Spacer3對應區(qū)域末端核苷酸下游第3位G和第4位C核苷酸之間插入1個腺嘌呤核苷酸A。這3個編輯位點的突變都造成OsSUT5翻譯過程中肽鏈的提前終止。不過，突變體植株在營養(yǎng)生長期間外形和野生型材料沒有明顯差異。

然而，到了生殖生長期間，由于突變株系抽出的稻穗較輕，所以它們的彎曲度較野生型稻穗的彎曲度?。▓D4-A和圖4-B）。對的3個突變株系結實率統(tǒng)計結果顯示（圖4-E），突變體植株空粒（即沒有成功授粉引起子房膨大的小穗）的比例較野生型的明顯增多。相對于野生型的7%，3個突變株系的空粒率分別約為20%、13%和13%。不過，癟粒（授粉后子房膨大但沒有灌漿的流產穎果）在野生型和突變株系之間無顯著區(qū)別。比較突變體和野生型水稻的千粒重，顯示它們之間無明顯區(qū)別（圖4-H）。值得注意的是，突變體的穎果堊白明顯增加，而野生型水稻穎果的堊白較少（圖4-D和圖4-F）；并且突變體穎果長度較野生型有一定程度的增加（圖4-D和圖4-G）。將突變株系與野生型對照水稻連續(xù)種植了3代，結果均一致表明突變株系與野生型水稻之間結實率以及穎果的堊白和長度方面存在明顯差異。

2.3.2突變體的表型分析 為了探索敲除造成水稻結實率顯著下降的原因，首先比較野生型與突變水稻株系的花器官。它們在形態(tài)結構上并無明顯差異（結果未顯示）?；ǚ鄣腒I-I2染色顯示突變體花粉比野生型花粉的活性有輕微的降低（圖5-I）。相對于野生型約99%的碘染活性，3個突變株系花粉碘染活性分別為96%、96%和95%。為了進一步檢驗突變基因是否對花粉功能產生影響，對花粉的體外萌發(fā)進行了分析。通過將新鮮花粉抖落在淀粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)，1 h后觀察并統(tǒng)計它們萌發(fā)的比例（圖5-J），3個突變株系花粉的體外萌發(fā)率分別為50%、43%和52%，平均約為48%；而野生型對照的花粉體外萌發(fā)率約為65%。說明敲除導致突變植株花粉體外萌發(fā)率顯著降低。

2.3.3 SUT蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析 由于近年來不斷有新的SUT（C）家族基因被克隆，因此，從已發(fā)表的文章中收集到153個SUT（C）基因，并對它們進行系統(tǒng)發(fā)育分析。運用Clustal Omega進行氨基酸序列比對，然后通過MEGA-X進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結果顯示，這些蛋白可分為4個大的亞族（圖6）。其中OsSUT5和OsSUT1、OsSUT3屬于同一亞族Ⅲ。而AtSUT5則屬于亞族Ⅰ。這個結果與Sauer[5]的分類較為接近。不過，其系統(tǒng)中的OsSUT2和OsSUT4屬于同一亞族，而圖6結果顯示它們分別屬于Ⅱ和Ⅳ亞族。

3 討論

光合產物蔗糖運輸和分配對植物的生長發(fā)育有重要影響。蔗糖-質子主動運輸蛋白SUT（C）家族成員在此過程中的作用也逐步得到證實。本研究通過對在水稻日本晴不同器官和生長時期的qRT-PCR檢測，表明它在水稻莖、葉、花序以及發(fā)育早期的穎果中表達（圖1）。這個結果與Aoki等[10]用半定量PCR分析結果基本一致，但AOkI等的研究結果顯示該基因在葉片中表達更強，而本研究qRT-PCR結果表明，該基因在穎果中表達最強。蛋白水平上GUS示蹤的組織定位結果顯示在水稻的營養(yǎng)器官中，OsSUT5主要集中在維管束中表達；而在生殖生長期間，GUS染色結果顯示OsSUT5在花藥、特別是穎果的盾片和胚根鞘中有強烈的表達（圖2），提示該蛋白在花序和穎果發(fā)育過程中可能有重要作用。

為驗證OsSUT5的生理功能，本研究通過CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)構建了一系列的敲除純合突變植株并從中選取3個獨立株系進行表型分析。結果顯示，突變植株與野生型在株高、分蘗、穎花外形和千粒重方面均無明顯差異（圖4-H）。然而，結實情況統(tǒng)計顯示，3個突變株系中沒有授粉的小穗形成的空粒較野生型對照明顯增多（圖4-B和圖4-E）。突變株系的結實率也由野生型的90%左右下降到突變株系的80%左右。造成授粉失敗產生空粒的原因可能來源于花粉的活性降低和/或花粉管的萌發(fā)以及雌、雄配子的結合過程，所以本研究首先對突變株系花粉活性及其萌發(fā)率進行了比較。KI-I2染色結果（圖5）顯示，突變株系的花粉活性相對于野生型只有微弱的降低。然而，突變體花粉的萌發(fā)率由野生型的65%左右降低至突變株系的48%左右。這些結果說明突變株系結實率降低的原因很可能是由花粉活性及其萌發(fā)率降低造成的。

WT：野生型。ossut5-1、ossut5-17、ossut5-25為基因編輯水稻的3個純合突變株系。A：野生型水稻植株與OsSUT5突變植株對比；B：稻穗的形態(tài)比較；C：突變位點鑒定；D：穎果長度比較；E：結實率統(tǒng)計；F：穎果形態(tài)比較；G：穎果長度統(tǒng)計圖。H：穎果千粒重統(tǒng)計圖。E、G、H中不同小寫字母代表顯著差異（P<0.05）。下同

一個不容忽視的因素是，水稻授粉過程表現(xiàn)出一種群體效應，也就是一個小穗的柱頭通常接受20個甚至更多的花粉，所以通常不止一個花粉在柱頭上萌發(fā)并競爭與雌配子結合的機會，盡管絕大多數情況下最終只有一個花粉管中的精子進入子房完成雙受精[45-46]。因此，在花粉量較多的情況下即使花粉活性的比例不高也可能不會影響水稻的結實率。所以，突變株系結實率降低是否由花粉活性及其萌發(fā)率降低所致還需進一步證實。特別是將來觀察突變體水稻雌、雄配子結合過程才能夠對此做出準確的判斷。

與及其編碼蛋白在花序及發(fā)育早期的穎果中強烈表達[9]（圖1和圖2）相吻合的是，在粳稻日本晴中敲除顯著降低結實率（圖4-B和圖4-E）。盡管突變植株的千粒重并未受到顯著影響（圖4-H），但它們的穎果長度增加（圖4-D），而且堊白明顯增多（圖4-F和圖4-G）。此前也有研究顯示在秈稻品種明恢中轉入的反義基因同樣引起了穎果堊白增多[33]。由于堊白是水稻品質的重要指標[47]，說明敲除不僅影響了穎果的形態(tài)，而且也影響了水稻穎果的品質。

比較和的表達特性、分子水平上的功能特點和敲除它們對植株的影響，可以發(fā)現(xiàn)，這兩個蛋白都能夠運輸蔗糖。而且有研究顯示，AtSUC5還能夠運輸生物素[31]。不過，OsSUT5是否同樣能夠運輸生物素還有待驗證。此外，在胚乳中表達，敲除該基因導致擬南芥胚發(fā)育輕微延遲。本研究結果顯示敲除除了導致水稻結實率有顯著下降、其原因可能是由于花粉活性和萌發(fā)率下降造成以外（圖5），穎果的發(fā)育也受到了明顯的影響（圖4）。這些事實說明OsSUT5和AtSUT5的生理功能存在明顯的區(qū)別。實際上，從系統(tǒng)發(fā)育的角度來看，無論是本研究的系統(tǒng)發(fā)育分析（圖6。用最大似然法構建的ML樹結果類似，未顯示）還是此前已經報道的結果，在SUT（C）家族中，OsSUT5和AtSUC5都不屬于同一個亞族[5,10]。

紅色圓點標記表示水稻SUT蛋白。藍色圓點表示擬南芥SUC5。圖中153個蛋白及其Accession numbers見電子附表2

OsSUT5與已經報道的OsSUT1和OsSUT4在水稻穎果中都有較強的表達，而且敲除或降低這些基因的表達對水稻的結實率和產量都有明顯的影響[26,29-30]（圖4），這些結果凸顯了SUT作為蔗糖主動運輸蛋白在水稻穎果灌漿過程中的重要作用。另一方面，已有研究和本研究結果都表明、、和在水稻花粉發(fā)育中也有不可替代的作用[22,29-30,48-49]（圖5）。不過，敲除導致水稻因穎果不能灌漿而完全不育（未發(fā)表結果），而敲除和造成的后果相對較輕[29-30]（圖4），說明它們的功能也存在明顯的區(qū)別。

4 結論

OsSUT5不僅在花粉發(fā)育與萌發(fā)過程中有一定作用，而且敲除對水稻的結實率、穎果形態(tài)和品質也有明顯影響。SUT蛋白在水稻生殖生長期間特別是灌漿過程中作用更為突出，這些作用很可能與蔗糖的運輸和代謝相關。

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Function of Sucrose Transporter OsSUT5 in Rice Pollen Development and Seed Setting

ZHANG YaWen1, BAO ShuHui1, TANG ZhenJia1, WANG XiaoWen1,2, YANG Fang3, ZHANG DeChun4, HU YiBing1

1College of Resources & Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;3State Key Laboratory of Hybrid Rice, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072;4Bio-technology Research Center, China Three Gorges University, Yichang 443002, Hubei

【】 Sucrose is the main form of photosynthates transported in the plant, and sucrose transporters (or sucrose carrier, SUT/SUC) play important roles in the transport of sucrose across the plasma membrane between cells and allocation of sucrose among different tissues and organs. The rice SUT family possesses 5 members. Knockout of the genes encoding,,orconfers significant effects on rice indicating that the functions of these genes are indispensable. However, the physiological role of OsSUT5 has not been systematically characterized. This study aims at elucidating the function of OsSUT5 in rice growth and development and provides new evidence for a comprehensive understanding of SUT’s role in model plant rice. 【】In this study, the temporal and spatial expression pattern ofwas analyzed via quantitative real-time PCR. The tissue localization of OsSUT5 in rice was tested via GUS represented expressions driven by the putative promoter ofand subcellular localization of transiently expressed OsSUT5-GFP fusion protein was observed in leaf cells of tobacco. In addition, CRISPR-Cas9 mediated gene editing was employed to create mutant lines of the gene for the characterization of. 【】Our results show thatwas expressed in culm, leaf, inflorescence, and caryopsis of rice but it was predominantly expressed in inflorescence and developing caryopsis at the transcriptional level. At the protein level, it was prominently expressed in the vascular bundles of rice vegetative organs. In reproductive organs, the protein was mainly expressed in the anther and developing caryopsis, particularly in the scutellum and coleorhiza. Transient expression of OsSUT5-GFP fusion protein in epidermis cells of tobacco leaf indicated that it was localized on the plasma membrane. Compared with the wild-type control, three homozygous mutant lines ofcreated via CRISPR-Cas9 gene-editing system consistently showed reduced pollen viability, a lower percentage of germination rates. Accordingly, the percentage of unpollinated florets and seed-setting rate decreased significantly. Comparison ofmutant lines and the wild-type control showed that more chalk was observed in the mutant caryopses than that of the wild type. In the mutant lines, caryopsis length increased but 1000 grain weight didn’t show a significant difference between the mutants and the wild-type control based on statistics. 【】These results indicate that OsSUT5 played an important role in pollen development and probably also in the fertilization process. Knockout of the gene affected the morphology and quality of rice caryopsis. Given the sucrose transport capacity of OsSUT5 and its plasma membrane localization, it can be deduced that function of OsSUT5 including its influence on rice pollen viability and endosperm development is related to its sucrose transport activity at the cellular level.

rice; OsSUT5; CRISPR-Cas9; pollen germination; seed setting rate; chalk

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.001

2020-12-18；

2021-02-12

國家自然科學基金（31371596）、武漢大學雜交水稻國家重點實驗室開放基金（KF202104）

張雅文，E-mail：zyw0615yaya@163.com。通信作者胡一兵，E-mail：huyb@njau.edu.cn。通信作者張德春，E-mail：zhangdc227@163.com

（責任編輯 李莉）