豬鏈球菌納米PCR檢測方法的建立和應用

張昆麗，林本夫，席振軍，楊冬霞，卞志標，宋 帥，蔣智勇，蔡汝健，李春玲

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院 動物衛(wèi)生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學觀測實驗站，廣東 廣州 510640；2.廣州市花都區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東 廣州 510800)

豬鏈球菌病屬于國家規(guī)定的二類動物疫病，是由豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)感染引起的人畜共患傳染病。該病以急性敗血癥、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎和急性死亡為主要特征，各年齡段的豬均可發(fā)病，且對低日齡仔豬危害尤為嚴重，臨床上豬鏈球菌常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌混合感染或繼發(fā)感染，導致豬群發(fā)病率和死亡率明顯上升，嚴重制約我國乃至世界生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1]。感染豬鏈球菌的病豬及其相關(guān)制品具有傳染性，主要感染養(yǎng)殖業(yè)和食品加工從業(yè)者，引起腦膜炎、心內(nèi)膜炎、中毒性休克，甚至死亡，死亡率可達17.8%，給全球公共衛(wèi)生安全帶來巨大隱患[2-3]。快速高效的早期診斷對傳染性疾病的控制與治療具有重要作用，因此，開展豬鏈球菌新型檢測技術(shù)的研究，豐富豬鏈球菌檢測技術(shù)平臺，對防止豬鏈球菌的傳播與流行，保障我國生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展及從業(yè)人員的健康具有重要意義。

根據(jù)菌體莢膜的抗原特性，目前，豬鏈球菌共有35個血清型(1～34型和1/2型)，其中2型(SS2)分布范圍最廣、毒力最強，對豬的致死率最高，血清1、7和9型也是目前臨床上較常見的致病血清型，豬鏈球菌往往多種血清型混合感染或先后感染[4]。豬鏈球菌的檢測方法包括病原學診斷和血清學診斷，其中病原學診斷主要以細菌分離鑒定、普通PCR、熒光定量PCR等分子生物學手段為主。細菌分離鑒定是細菌性傳染病診斷的金標準，但該過程繁瑣費時費力，加之臨床多病原混合感染嚴重，樣品采集和保存不當常常導致病原菌分離失敗。豬鏈球菌的血清學診斷方法主要有凝集試驗、ELISA、膠體金免疫層析方法、熒光檢測方法等，這類方法簡便快速，但與分子生物學檢測方法相比，靈敏度相對較低，假陽性較多[5-7]。豬鏈球菌的主要毒力因子谷氨酸脫氫酶 (Glutamate dehydrogenase，GDH)，具有良好的免疫原性，且編碼基因保守性較好，常作為豬鏈球菌分子生物學檢測的靶標基因[8]。目前，已建立多種關(guān)于豬鏈球菌的PCR檢測方法，其中普通PCR具有經(jīng)濟、高效的特點，使用頻率較高，但該方法檢測敏感性相對較低，無法適應微量檢測需求，熒光定量PCR檢測靈敏度比普通PCR高10倍以上，但儀器設備及試劑耗材昂貴，基層推廣應用較難[9]。近年來，隨著材料學的高速發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)納米材料除了在藥物、疫苗等生命領域具有重要作用，也適用于檢測試劑盒開發(fā)，如納米PCR技術(shù)。納米PCR技術(shù)是納米材料學與現(xiàn)代分子生物學相結(jié)合的新型技術(shù)，通過在PCR反應體系中添加一定量的納米金屬顆粒，利用其加強啟動DNA聚合酶、調(diào)節(jié)DNA聚合酶活性、增強體系導熱性能等特點，縮短反應時間，促進特異性產(chǎn)物的擴增，提高PCR檢測方法的靈敏度[10]。目前，該新型檢測技術(shù)已逐步應用到非洲豬瘟、豬流行性乙型腦炎、禽傳染性關(guān)節(jié)炎及犬細小病毒感染等動物疫病的檢測中，但該技術(shù)在細菌性疫病中的應用鮮見報道[11-14]。因此，本研究旨在針對SS感染，試圖尋求一種更高效、更快捷的檢測方法，通過加入納米顆粒建立豬鏈球菌納米PCR檢測技術(shù)，為我國豬鏈球菌的基層防控及檢驗檢疫提供技術(shù)儲備。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)為OXOID公司產(chǎn)品，新生犢牛血清為四季青生物制品有限公司產(chǎn)品，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)為南京生興生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。細菌DNA提取試劑盒為大連寶生物科技有限公司產(chǎn)品，2×PCR Buffer、Taq酶、DL2000 DNA Marker等為南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品，納米PCR試劑盒為上海滬崢生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 菌株

血清1、2、7和9型的豬鏈球菌(SS)、血清7型的豬胸膜肺炎放線桿菌(APP)、血清5型的副豬嗜血桿菌(H.parasuis)、豬大腸桿菌(swineE.coli)、豬沙門氏菌(S.suis)、豬葡萄球菌(S.hyicus)由廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所豬病研究室提供。

1.3 細菌培養(yǎng)與基因組DNA提取

用TSB培養(yǎng)基(含10%犢牛血清，30 mg/L NAD)37 ℃ 220 r/min分別培養(yǎng)1.2的菌株12 h，12 000 r/min離心5 min獲得細菌團塊。按照1.1中的細菌DNA提取試劑盒說明書，抽提不同細菌的DNA，經(jīng)紫外線分光光度計測定濃度后，保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 豬鏈球菌納米PCR引物設計與合成

以豬鏈球菌谷氨酸脫氫酶基因(gdh)為模板，用Primer 5.0軟件設計特異性引物，SS-F：5′-CATGGACAGATAAAGATGGA-3′，SS-R：5′-CAGCGTATTCTGTCAAACGA-3′，目的片段大小為687 bp，經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，用ddH2O將引物稀釋至10 pmol/μL，保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 豬鏈球菌納米PCR反應體系優(yōu)化

以豬鏈球菌的DNA為模板，PCR擴增SS的gdh基因。納米PCR反應體系與普通PCR反應體系均預設定為16.0 μL：10 pmol/μL的上、下游引物各1 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)1 μL、MgCl2(25 mmol/L)1 μL、PCRTaq酶(5 U/μL)0.2 μL、DNA(50 ng/μL)1 μL、 ddH2O 補齊，納米PCR使用2×Nano PCR Buffer，普通PCR反應使用2×PCR Buffer，均各加8 μL。擴增程序為：94 ℃ 30 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠分離，并用天能凝膠成像系統(tǒng)拍照。

利用梯度PCR儀依次優(yōu)化退火溫度和引物濃度，根據(jù)瓊脂糖核酸電泳結(jié)果，判定最佳的退火溫度和引物濃度，明確納米PCR反應體系。設定梯度PCR儀的退火溫度為51～60 ℃，按照預設反應體系加樣后，進行PCR反應，確定最佳退火溫度；保持細菌DNA及其他組分用量不變，依次增加引物濃度，引物使用量從0.6 μL開始，以0.1 μL遞增至1.9 μL，按照已確定的退火溫度進行PCR反應，明確最佳引物濃度。

1.6 豬鏈球菌納米PCR特異性試驗

以臨床常見的幾種主要的豬細菌性病原，SS(2型)、APP(7型)、H.parasuis(5型)、swineE.coli、S.suis、S.hyicus的DNA為模板，按已優(yōu)化的納米PCR反應條件進行PCR擴增，判定該方法對豬鏈球菌的特異性。同時，提取豬鏈球菌在我國流行的其他主要致病血清型菌株，1(SS-1型)、7(SS-7型)和9型(SS-9)的基因組DNA，并用該方法進行檢測，判定本研究建立的納米PCR方法對豬鏈球菌不同血清型菌株的特異性。

1.7 豬鏈球菌納米PCR敏感性試驗

取培養(yǎng)過夜的SS菌液，通過倍比稀釋后進行平板計數(shù)，根據(jù)菌液濃度，將細菌調(diào)整至1×109cfu/mL，然后10倍濃度梯度稀釋至1×10 cfu/mL，按照1.5已優(yōu)化的反應體系分別進行納米PCR、普通PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖核酸電泳后，比較納米PCR和普通PCR對SS檢測敏感度，重復3次試驗。

1.8 豬鏈球菌納米PCR重復性試驗

提取豬鏈球菌(1×106cfu/mL)基因組DNA，并將其稀釋10，100倍，以上述3個梯度的DNA作為模板，每個濃度梯度設3個重復，進行重復性試驗。

1.9 豬鏈球菌臨床樣品檢測

提取疑似豬鏈球菌感染的44份臨床樣品的DNA，分別用普通PCR及本研究建立的納米PCR方法進行樣品檢測，并統(tǒng)計陽性率。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬鏈球菌納米PCR反應體系及條件的優(yōu)化

依次優(yōu)化退火溫度(圖1)和引物濃度(圖2)后，豬鏈球菌納米PCR的反應體系如下：上、下游引物(10 pmol/μL)各1.1 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)1 μL、MgCl2(25 mmol/L)1 μL、Taq酶(5 U/μL)0.2 μL、DNA(50 ng/μL)1 μL、2×Nano PCR Buffer 8.0 μL、ddH2O補足16.0 μL。擴增程序為：94 ℃ 30 s，53 ℃ 35 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)35個反應。

M.DNA分子質(zhì)量標準DL2000；1-10.51～60 ℃；11.H2O。M.DL2000 DNA Marker；1-10.51-60 ℃；11.H2O.

M.DNA分子質(zhì)量標準DL2000；1-14.0.6～1.9 μL；15.H2O。M.DL2000 DNA Marker；1-14.0.6-1.9 μL；15.H2O.

2.2 豬鏈球菌納米PCR特異性試驗

以SS(2型)、APP(7型)、H.parasuis(5型)、swineE.coli、S.suis、S.hyicus的DNA為模板，同時以H2O作為陰性對照，按照1.5已優(yōu)化的納米PCR反應條件擴增。經(jīng)電泳檢測表明，僅有SS(2型)的DNA樣品擴增得到687 bp的DNA片段，其余細菌樣品的PCR結(jié)果均為陰性，說明本研究建立的豬鏈球菌納米PCR方法與其他細菌無交叉反應，具有良好的種屬特異性(圖3)。然后，用該方法檢測我國流行的豬鏈球菌其他主要致病血清型菌株1(SS-1型)、7(SS-7型)和9型(SS-9)的基因組DNA，同時設立陰性對照，結(jié)果顯示，該方法能同時識別1、2、7和9型的豬鏈球菌(圖4)。綜上，表明該方法特異性良好。

M.DNA分子質(zhì)量標準DL2000；1.豬鏈球菌(2型)；2.豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌；3.副豬嗜血桿菌；4.豬大腸桿菌；5.豬沙門氏菌；6.豬葡萄球菌；7.H2O。

2.3 豬鏈球菌納米PCR敏感性試驗

先用TSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)豬鏈球菌12 h，經(jīng)平板計數(shù)法測定豬鏈球菌菌落總數(shù)后，將細菌的濃度調(diào)整至1×109cfu/mL，用滅菌水將鏈球菌按10倍濃度梯度依次稀釋至10 cfu/mL，進行納米PCR及普通PCR擴增。反應結(jié)束后進行瓊脂糖凝膠核酸電泳。結(jié)果如下圖所示，納米PCR和普通PCR對豬鏈球菌的檢測下限分別為10，103cfu/mL，表明本研究建立的豬鏈球菌納米PCR靈敏度顯著增加，其敏感性比普通PCR提高了100倍(圖5)。

M.DNA分子質(zhì)量標準DL2000；1. 豬鏈球菌-1型；2.豬鏈球菌-2型；3.豬鏈球菌-7型；4.豬鏈球菌-9型；5.H2O。

M.DNA分子質(zhì)量標準DL2000；1-9. 109～10 cfu/mL；10.H2O。M.DL2000 DNA Marker；1-9. 109-10 cfu/mL；10.H2O.

2.4 豬鏈球菌納米PCR重復性試驗結(jié)果

提取豬鏈球菌(1×106cfu/mL)基因組DNA，并將其進行3個濃度梯度稀釋，每個梯度設3個重復，進行重復性試驗。結(jié)果表明，不同濃度梯度的SS基因組DNA均能有效擴增，說明該方法穩(wěn)定性好(圖6)。

2.5 臨床樣品檢測結(jié)果

根據(jù)臨床癥狀，收集來自廣東不同地區(qū)的44份疑似豬鏈球菌感染的病料，按照1.3的方法提取上述樣品中的DNA，分別用豬鏈球菌的常規(guī)PCR方法和本研究建立的納米PCR方法檢測，結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌普通PCR和納米PCR方法對該菌的陽性檢出率分別為54.5%(24/44)，72.7%(32/44)，且納米PCR檢測出的陽性、陰性樣品與普通PCR檢測結(jié)果100%符合，可見納米PCR不僅準確度較好，檢出率與普通PCR相比提高18.2百分點，顯著提高了豬鏈球菌感染的檢驗檢疫率(表1)。

M.DNA分子質(zhì)量標準DL2000；1-3. 1×106 cfu/mL；3-6. 1×105 cfu/mL；7-9. 1×104 cfu/mL；10. H2O。M. DL2000 DNA Marker；1-3.1×106 cfu/mL；3-6.1×105 cfu/mL；7-9. 1×104 cfu/mL；10.H2O.

結(jié)果Testing results普通PCRRoutine PCR納米PCRNano PCR陽性總數(shù)24/4432/44Total number of positive陽性率/%54.572.7The positive rate陰性總數(shù)20/4412/44Total number of negative total陰性率/%45.527.3The negative rate

3 討論

納米PCR技術(shù)是在PCR反應體系中添加1～100 nm的納米金屬顆粒，形成納米流體，將PCR技術(shù)從均相體系擴展到納米粒子表面。金屬納米粒子優(yōu)良的熱傳導性，提高了PCR反應體系的升溫和降溫速度，利于模板和引物的高效配對，增加擴增的特異性與反應速率[15]。通過掃描電鏡和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，納米材料能夠附著于DNA分子和Taq酶表面。研究發(fā)現(xiàn)，納米材料能夠和DNA分子進行非共價結(jié)合，調(diào)節(jié)反應體系中DNA的聚合及穩(wěn)定性，降低模板Tm，進而提升擴增效率；納米粒子還能與游離的Taq酶進行可逆結(jié)合，動態(tài)調(diào)節(jié)Taq酶的更替頻率，進一步提高PCR擴增效率[10，16]。納米材料還能通過電荷效應等極大地提高反應物組分的動力學接觸，從而提高PCR反應效率，減少DNA的用量，提高PCR的擴增效率和敏感性[17]。目前，納米粒子在長片段PCR、反復擴增PCR、實時定量PCR等方面已取得較好應用結(jié)果，報道表明，納米PCR方法比常規(guī)PCR方法敏感性可提高10～1 000倍，顯著改進了PCR反應的擴增效率與特異性[18]?？梢?，納米材料具有傳統(tǒng)PCR反應添加劑無法達到的特殊效果，為PCR反應的優(yōu)化，提供了新思路、新技術(shù)。將納米PCR技術(shù)應用于動物疫病研究中，可為動物疫病的早期診斷及控制提供更加高效準確的檢測技術(shù)平臺。目前，該技術(shù)在多種動物病毒性疫病的檢測中敏感性顯著提高，但細菌性動物疫病的檢測中鮮少用到該技術(shù)。

豬鏈球菌是豬場中常見的重要細菌性病原，通過昆蟲媒介、糞口途徑、呼吸道途徑，甚至垂直傳播，感染不同年齡段的豬，仔豬感染表現(xiàn)為急性敗血癥和腦腦炎，病程較短死亡率極高，中豬多表現(xiàn)為化膿性淋巴結(jié)炎[19]。目前，該病遍布全球，常呈地方性爆發(fā)流行，該菌現(xiàn)有35個血清型，其中2型豬鏈球菌流行范圍最廣泛，此外，1、7、9型也是較常見的致病性血清型，且2、9型對人具有感染性，世界多地區(qū)曾有感染病例報道，可見豬鏈球菌是重要的人畜共患病病原，具有重要公共衛(wèi)生安全意義[20]。建立高效的分子診斷手段有利于從源頭上監(jiān)測該病的流行情況，利于早期感染的檢測與控制。本研究通過引入納米金屬顆粒，提高PCR反應效率和敏感性，建立了以谷氨酸脫氫酶基因為檢測靶標的豬鏈球菌納米PCR檢測方法。該方法滿足臨床上多血清型混合感染的檢測需求，能同時檢測到1、2、7和9型4個主要流行血清型，與其他豬場常見的細菌性病原豬胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌均無交叉反應，且與傳統(tǒng)PCR方法相比，敏感性提高100倍。臨床樣品檢測結(jié)果顯示，本研究建立的納米PCR方法大大提升了豬鏈球病的檢出效率，雖然該技術(shù)無法區(qū)分豬鏈球菌具體血清型，但該技術(shù)能同時檢測出目前流行的4個主要致病血清型，且陽性樣本的檢出率比普通PCR高18.2百分點，可作為豬鏈球菌感染早期診斷的高效篩查技術(shù)。綜上，本研究建立的豬鏈球菌納米PCR檢測方法不僅實用性強，特異好，且檢測敏感度更佳，為豬鏈球菌病的臨床診斷和檢測提供了新的技術(shù)支持。