王俊紅,王星琳,2,王 康 ,任振興 ,王夢(mèng)亮
(1.山西大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)研究所,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所,山西 太原 030006)
20世紀(jì)80年代至今,我國(guó)糧食產(chǎn)量增加73%,同時(shí)化肥用量增加476%,農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所用氮肥利用率僅為30%左右[1]。傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)對(duì)化肥的過度依賴,破壞了土壤養(yǎng)分平衡與微生物群落的穩(wěn)定[2],嚴(yán)重威脅著資源與環(huán)境安全,不利于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。生物有機(jī)肥是肥菌兼具的新一代微生物肥料,憑借其綠色安全、節(jié)約資源的優(yōu)勢(shì)成為我國(guó)農(nóng)業(yè)綠色、可持續(xù)發(fā)展的突破口[3]。有研究表明[4-5],生物有機(jī)肥替代部分化肥,有利于改善土壤養(yǎng)分循環(huán)、增加土壤酶活性、提高作物產(chǎn)量與品質(zhì)。劉雷等[6]研究發(fā)現(xiàn),增施生物有機(jī)肥顯著提高了根際土壤酶的活性,改善了土壤肥力水平。此外,生物有機(jī)肥中含有的大量促生菌,在促進(jìn)根系生長(zhǎng),增強(qiáng)作物抗病、抗逆性方面發(fā)揮不可替代的作用[7-8]。Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn),生物有機(jī)肥使土壤微生物多樣性與豐富度升高,土壤養(yǎng)分循環(huán)與有機(jī)質(zhì)的代謝更加旺盛,顯示出更高的生產(chǎn)力以及更強(qiáng)的抗病、抗逆性[10]。陸海飛等[11]研究發(fā)現(xiàn),配施生物有機(jī)肥后,土壤細(xì)菌群落多樣性與豐富度指數(shù)顯著增加。因此,通過生物有機(jī)肥調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與活動(dòng),在保證產(chǎn)量的基礎(chǔ)上,減少化肥的施用,對(duì)于解決過量施肥帶來的環(huán)境污染問題、實(shí)現(xiàn)“綠色農(nóng)業(yè)”具有重要的意義[12]。
小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物,保障其產(chǎn)量持續(xù)穩(wěn)定地增加,關(guān)乎國(guó)家的糧食安全。將生物有機(jī)肥應(yīng)用于麥田土壤,利用其可改善土壤養(yǎng)分循環(huán)、調(diào)節(jié)根際微生物區(qū)系、提高產(chǎn)量與品質(zhì),探索生物有機(jī)肥替代部分化肥的科學(xué)比例與用量,對(duì)于促進(jìn)我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。目前,關(guān)于生物有機(jī)肥替代部分化肥對(duì)小麥產(chǎn)量構(gòu)成、生育期內(nèi)酶活影響的報(bào)道較多,但是通過高通量測(cè)序技術(shù),研究生物有機(jī)肥對(duì)小麥根際微生物群落結(jié)構(gòu)調(diào)控機(jī)制尚不多見。
本試驗(yàn)以大田小麥為研究對(duì)象,探索生物有機(jī)肥替代部分化肥對(duì)小麥根際土壤養(yǎng)分、酶活、土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響,并通過冗余分析研究上述環(huán)境因子與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性,旨在為改良傳統(tǒng)施肥模式,促進(jìn)化肥的減量增效,推進(jìn)生物有機(jī)肥規(guī)?;瘧?yīng)用提供理論支持。
試驗(yàn)地點(diǎn)位于山西省臨汾市洪洞縣秦壁村(36°13′40.03″N,111°42′1.85″E),平均海拔為530 m,屬溫帶季風(fēng)氣候,年平均溫度12.3 ℃,年平均降水量493.3 mm,土壤類型為褐土。
供試小麥品種為莘麥818,由山東莘州種業(yè)有限公司育種;供試化肥為復(fù)合肥料(N∶P2O5∶K2O=25∶14∶6);供試生物有機(jī)肥的有機(jī)質(zhì)含量≥45%,功能菌種為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(有效活菌數(shù)≥1.0×109cfu/g),由太原山大新科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。
1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2019年10月9日至2020年6月10日進(jìn)行,采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),共設(shè)4個(gè)處理,每個(gè)處理3次重復(fù)。小區(qū)面積50.0 m2(25.0 m×2.0 m)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表1。
表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Tab.1 Design of experimental treatment
1.3.2 樣品采集與處理 2020年4月18日,在小麥的拔節(jié)期采集土壤樣品。采用五點(diǎn)取樣法,去除表層浮土后,收集0~20 cm小麥根際部位土樣,混合均勻,其中一部分土樣自然風(fēng)干后過0.2 mm篩,用于后續(xù)土壤養(yǎng)分含量的測(cè)定;另一部分土壤樣品在4 ℃環(huán)境下保存,用于土壤酶活的測(cè)定和土壤DNA的提取。
1.3.3 土壤細(xì)菌 總DNA提取與PCR擴(kuò)增使用PowerSoil DNA Isolation Kit(MoBio)試劑盒提取土壤總DNA;采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的大小與完整性,采用Nanodrop 2000檢測(cè)提取DNA的純度。
采用通用引物338F對(duì)細(xì)菌16S rRNA的V3~V4區(qū)進(jìn)行特異性擴(kuò)增,在338F的3′端添加特異的Barcode序列區(qū)分樣品。PCR反應(yīng)體系為25 μL;反應(yīng)條件為:98 ℃預(yù)變性 2 min;98 ℃變性15 s,55 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸30 s,共25個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min,反應(yīng)結(jié)束,產(chǎn)物混勻后通過2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并將產(chǎn)物進(jìn)行純化,回收目標(biāo)片段,按照各樣本測(cè)序的需用量,將各產(chǎn)物等摩爾數(shù)混合。文庫的構(gòu)建與高通量測(cè)序委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成,測(cè)序平臺(tái)為Illumina MiSeq平臺(tái)。
1.4.1 土壤養(yǎng)分含量 土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)含量測(cè)定采用低溫外熱重鉻酸鉀比色法;全氮(TN)含量測(cè)定采用凱氏定氮法;速效磷(AP)含量測(cè)定采用鉬銻抗比色法;速效鉀(AK)含量測(cè)定采用火焰分光光度計(jì)法[13]。
1.4.2 土壤酶活測(cè)定 土壤脲酶(Solid-Urease,S-UE)活性測(cè)定采用苯酚-次氯酸鈉比色法;蔗糖酶(Solid-Sucrase,S-SC)活性測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸比色法;中性磷酸酶(Soild-neutral-phosphatase,S-NP)活性測(cè)定采用磷酸苯二鈉比色法。所用土壤脲酶、蔗糖酶和中性磷酸酶試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。
1.4.3 小麥產(chǎn)量的測(cè)定 于6月10日在小麥?zhǔn)斋@期測(cè)定小麥產(chǎn)量。各處理隨機(jī)選取3個(gè)1 m2的樣點(diǎn),對(duì)小麥株高、穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量和產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
測(cè)序結(jié)果首先運(yùn)用Qiimev1.8.0軟件識(shí)別疑問序列,調(diào)用USEARCH檢查并剔除嵌合體序列,獲得Effective Tags;隨后采用序列比對(duì)軟件UCLUSTv5.2.236對(duì)得到的Effective Tags按照97%的相似度進(jìn)行OTU聚類[14],并選取其中出現(xiàn)頻率最高的序列作為代表序列,最終通過數(shù)據(jù)庫分析確定各OTU對(duì)應(yīng)的分類水平[15]。
數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 23.0 軟件進(jìn)行,采用Canoco for Windows 5.0軟件對(duì)土壤養(yǎng)分、酶活和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性進(jìn)行冗余分析(Redundancy analysis,RDA)。
土壤養(yǎng)分含量反映土壤的肥力水平,直接影響作物的生長(zhǎng)狀況。由表2可知,CK處理SOM、AP和AK養(yǎng)分含量均為最低;與NPK處理相比,生物有機(jī)肥替代部分化肥(MNPK、MDNPK)提高了根際土壤有機(jī)質(zhì)、總氮、速效磷、速效鉀含量,其中,化肥減量10%+生物有機(jī)肥(MNPK)處理有機(jī)質(zhì)、總氮、速效磷、速效鉀含量均最高,較NPK處理分別增加17.4%,12.4%,16.2%,19.2%。
表2 不同處理對(duì)小麥根際土壤養(yǎng)分含量的影響Tab.2 Effects of different treatments on the nutrient content of wheat rhizosphere soil
脲酶是促進(jìn)土壤氮素循環(huán)的關(guān)鍵酶,可以增加土壤中銨態(tài)氮的含量,促進(jìn)植物根系對(duì)氮素的吸收利用[16]。蔗糖酶又稱轉(zhuǎn)化酶,參與土壤碳素循環(huán)過程,與土壤中有機(jī)質(zhì)含量和根際微生物豐富度、多樣性密切相關(guān)[17]。磷酸酶是一種水解性酶,能促進(jìn)土壤脫磷,提高土壤中有效磷的含量。由表3可知,CK處理的土壤脲酶、蔗糖酶和中性磷酸酶的活性均為最低;與NPK相比,生物有機(jī)肥替代部分化肥(MNPK、MDNPK)處理提高了土壤脲酶、蔗糖酶和中性磷酸酶的活性,其中,MNPK處理S-UE與S-SC活性較NPK處理分別顯著升高19.0%和9.7%(P<0.05);MNPK和MDNPK處理,S-NP活性較NPK處理分別顯著升高18.3%,21.2%(P<0.05),但MNPK和MDNPK處理間差異不顯著。結(jié)果表明,MNPK處理顯著增加了土壤中S-UE、S-SC、S-NP的活性,與土壤養(yǎng)分含量結(jié)果變化一致。
表3 不同處理對(duì)小麥根際土壤酶活影響Tab.3 Effects of different treatments on soil enzyme activities in wheat rhizosphere mg/g
16S rRNA高通量測(cè)序得到的初始序列經(jīng)質(zhì)量篩查后,共得到642 180條有效序列,基于97%的相似性進(jìn)行歸并與劃分,一共得到12 452個(gè)OTU,分別屬于29門93綱190目293科528屬。通過對(duì)不同處理細(xì)菌群落OTU變化的Venn圖分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖1),CK、NPK、MNPK、MDNPK這4個(gè)處理分別得到5 990,5 942,6 034,5 690個(gè)OTU;4個(gè)處理共有的OTU數(shù)有2 073個(gè);特有的OTU數(shù)分別為1 640,2 089,1 577,1 460個(gè),其中,NPK處理中特有的OTU數(shù)占總OTU數(shù)的51.3%,說明僅施化肥會(huì)使小麥根際土壤細(xì)菌群落OTU數(shù)發(fā)生顯著變化。
Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)用于評(píng)價(jià)群落豐富度,其中,Chao1指數(shù)用于估計(jì)群落樣本中的OTU數(shù),能更好地評(píng)價(jià)低豐度物種的分布狀況,ACE指數(shù)用來估計(jì)群落樣本中的OTU數(shù),體現(xiàn)了某一OTU在樣本中出現(xiàn)的概率;Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用于評(píng)價(jià)群落多樣性與均勻度。由表4可知,NPK處理Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均為最低,其中,NPK處理的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)顯著低于MNPK與MDNPK處理。說明只施化肥顯著降低了土壤細(xì)菌群落豐富度,生物有機(jī)肥替代部分化肥有助于恢復(fù)土壤細(xì)菌群落多樣性與豐富度。
圖1 不同處理土壤細(xì)菌群落OTU Venn圖Fig.1 Venn diagram of soil bacterial community OTUs in soil samples from different treatments
表4 不同處理土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Tab.4 Diversity indices statistical results of soil bacterial communities in different treatments
2.4.1 基于細(xì)菌門水平上群落結(jié)構(gòu)變化 各處理門水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)如圖2所示,在相對(duì)豐度前10的門中,變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)為優(yōu)勢(shì)菌門,在CK、NPK、MNPK、MDNPK這4個(gè)處理中,變形菌門的豐度最高,占29.7%~36.0%;放線菌門占15.4%~17.8%;酸桿菌門占14.6%~19.0%,綠彎菌門占11.4%~12.3%;芽單胞菌門占6.7%~10.9%。在CK、NPK、MNPK、MDNPK這4個(gè)處理中,5個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門的豐度分別為86.0%,86.9%,87.2%,85.1%,無顯著差異。擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、己科河菌門(Rokubacteria)、髕骨細(xì)菌門(Patescibacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)等其他菌門豐度較低,為劣勢(shì)菌門。與NPK處理相比,MNPK與MDNPK處理的變形菌門豐度顯著升高(P<0.05),MNPK處理的芽單胞菌門豐度顯著升高(P<0.05),其余菌門豐度并無顯著變化。結(jié)果表明,生物有機(jī)肥替代部分化肥使變性菌門、芽單胞菌門這些功能菌門豐度升高,且能夠平衡根際土壤中優(yōu)勢(shì)菌門的豐度。
2.4.2 基于細(xì)菌屬水平上群落結(jié)構(gòu)變化 由圖3可知,不同處理間細(xì)菌群落組成及分布相似,選取豐度前20菌屬進(jìn)行分析,相對(duì)豐度>1%的一共有11個(gè)菌屬。與CK處理相比,MNPK處理豐度升高的有鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、水沉積物桿菌屬(Ilumatobacter)、溶桿菌屬(Lysobacter)、藤黃色單胞菌屬(Luteimonas)、野野村菌屬(Nonomuraea)、Iamia、馬賽菌屬(Massilia)等7個(gè)菌屬;赭黃嗜鹽囊菌屬(Haliangium)、MND1、RB41、Subgroup_10這4個(gè)菌屬豐度降低,其中,Subgroup_10豐度顯著降低(P<0.05)。與CK處理相比,MDNPK處理豐度升高的有鞘氨醇單胞菌屬、水沉積物桿菌屬、溶桿菌屬、馬賽菌屬、藤黃色單胞菌屬這5個(gè)菌屬,其中,鞘氨醇單胞菌屬豐度顯著升高(P<0.05);MND1、野野村氏菌zamia、RB41、Iamia、Subgroup_10、赭黃嗜鹽囊菌屬這6個(gè)菌屬豐度降低,其中,赭黃嗜鹽囊菌屬豐度顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明,生物有機(jī)肥部分替代化肥使小麥根際土壤中鞘氨醇單胞菌屬、水沉積物桿菌屬、溶桿菌屬、馬賽菌屬豐度升高,赭黃嗜鹽囊菌屬、Subgroup_10豐度降低,但不會(huì)影響優(yōu)勢(shì)菌屬的種類。
圖2 不同處理對(duì)細(xì)菌門水平相對(duì)豐度的影響Fig.2 Effects of different treatments on the relative abundance of the bacterial phyla
圖3 不同處理對(duì)細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度的影響Fig.3 Effects of different treatments on the relative abundance of the bacterial genera
有研究表明,不同的環(huán)境因子會(huì)影響土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)[18-19]。本研究采用冗余分析研究土壤養(yǎng)分含量、酶活對(duì)屬水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響,由圖4可知,土壤養(yǎng)分與酶活一共解釋了77.9%的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化,第1軸與第2軸分別解釋了響應(yīng)變量的51.8%和16.1%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),S-NP(P=0.034)和S-SC(P=0.016)是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要因子;S-NP、S-SC、TN與鞘氨醇單胞菌屬、溶桿菌屬、交替紅色桿菌屬、硝化螺旋菌屬的豐度正相關(guān),與RB41豐度負(fù)相關(guān);S-UE、SOM、AP、AK與水沉積物桿菌屬、野野村菌屬、Iamia、馬賽菌屬、德沃斯氏菌屬、新根瘤菌屬、Bryobacter豐度正相關(guān),與MND1、Subgroup_10、赭黃嗜鹽囊菌屬豐度負(fù)相關(guān)。
圖4 屬水平上細(xì)菌相對(duì)豐度與土壤養(yǎng)分含量、酶活的冗余分析(RDA)Fig.4 Redundancy analysis (RDA)among the relative abundance of the bacterial genera,soil nutrient content and enzyme activities
由表5可知,與單施化肥處理(NPK)相比,生物有機(jī)肥替代部分化肥處理對(duì)小麥株高、穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量等農(nóng)藝性狀均沒有顯著影響,與NPK處理相比,MNPK與MDNPK處理小麥產(chǎn)量顯著提高9.3%,4.4%(P<0.05)。與單施化肥相比,生物有機(jī)肥替代部分化肥處理可以保證小麥產(chǎn)量。
植物根際是植物根系、土壤、微生物相互作用的一個(gè)微區(qū)域。土壤酶活性反映土壤微生物的活性,能更迅速反映不同施肥處理對(duì)土壤養(yǎng)分水平的影響[20],在土壤有機(jī)質(zhì)分解與其他養(yǎng)分循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用[21-22]。土壤養(yǎng)分含量與土壤酶活共同反映土壤的肥力與功能水平,直接影響作物的生長(zhǎng)狀況,是評(píng)價(jià)土壤健康水平的重要指標(biāo)。
表5 不同處理對(duì)小麥農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量的影響Tab.5 Effects of different treatments on agronomic trait and yield of wheat
本研究結(jié)果表明,與NPK處理相比,MNPK與MDNPK處理后,小麥根際土壤養(yǎng)分SOM、TN、AP、AK含量與土壤酶S-UE、S-SC、S-NP活性均有增加的趨勢(shì),且MNPK處理效果最佳,說明化肥與生物有機(jī)肥合理組合,能夠顯著提高土壤養(yǎng)分含量與酶活水平。生物有機(jī)肥中含有大量有機(jī)質(zhì)與豐富養(yǎng)分,能改善根際微環(huán)境,促進(jìn)土壤養(yǎng)分的循環(huán)與積累,使土壤養(yǎng)分更加均衡,根系能更充分利用土壤養(yǎng)分,有助于土壤酶活性升高[23]。因此,生物有機(jī)肥替代部分化肥提高了土壤養(yǎng)分SOM、TN、AP、AK的含量以及土壤S-UE、S-SC、S-N活性,這與文獻(xiàn)報(bào)道[24-25]的結(jié)果相一致。
生物有機(jī)肥中含有大量促生菌,根際促生菌是土壤微環(huán)境的重要組成部分,參與到有機(jī)質(zhì)的分解、養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化等一系列土壤生物代謝過程,能降低過量施肥造成的生態(tài)退化,幫助修復(fù)土壤微生態(tài),抑制土壤傳播疾病。本試驗(yàn)對(duì)小麥根際土壤細(xì)菌群落進(jìn)行高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn),生物有機(jī)肥替代部分化肥后土壤中變形菌門豐度明顯升高,放線菌門豐度降低。變形菌門是一類具有固氮作用的功能微生物,其豐度升高,有利于土壤中氮素的積累和轉(zhuǎn)化利用[26-27],放線菌門適宜生活于有機(jī)質(zhì)含量較低的環(huán)境中,肥料中有機(jī)質(zhì)的輸入導(dǎo)致放線菌門豐度降低;相反酸桿菌門、擬桿菌門適宜于生活在養(yǎng)分含量高的環(huán)境中,故二者豐度呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)[28-29]。根際土壤中富集了鞘氨醇單胞菌屬、溶桿菌屬、硝化螺菌屬、馬賽菌屬等一些具有促生和生防作用的功能菌屬,其中,硝化螺菌屬是一類硝化細(xì)菌,將土壤中的亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽,供植物吸收利用;馬賽菌屬會(huì)定殖在植物根上[30],產(chǎn)生IAA和嗜鐵素,從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)[31-32]。
RDA分析顯示,S-SC與S-NP活性是引起細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要因素。生物有機(jī)肥替代部分化肥后,S-SC與S-NP活性與鞘氨醇單胞菌屬、溶桿菌屬、交替赤桿菌屬、硝化螺菌屬正相關(guān),AK含量與水沉積物桿菌屬、馬賽菌屬、新根瘤菌屬呈正相關(guān),這與Cheng等[33]的研究結(jié)果基本一致。結(jié)果表明,生物有機(jī)肥替代部分化肥能提高土壤養(yǎng)分有效性和酶活性,增強(qiáng)作物根際效應(yīng),定向富集具有生物防治與促生作用的功能微生物菌群,最終促進(jìn)作物產(chǎn)量的提高。
目前,過量施肥導(dǎo)致化肥利用率過低,土壤養(yǎng)分結(jié)構(gòu)與菌群多樣性失衡等問題急需解決,通過調(diào)整傳統(tǒng)“大水大肥”的施肥模式,探索適宜的生物有機(jī)肥替代化肥比例,可為解決該問題提供新的思路。本研究發(fā)現(xiàn),生物有機(jī)肥替代10%化肥與常規(guī)施肥相比,小麥產(chǎn)量顯著增加,但考慮到細(xì)菌群落組成與功能之間的復(fù)雜關(guān)系,短期施肥可能不足以使細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生穩(wěn)定的差異,需要進(jìn)行長(zhǎng)期定位試驗(yàn)。后續(xù)關(guān)于小麥在不同土壤環(huán)境下,生物有機(jī)肥替代化肥最適比例仍有待進(jìn)一步研究。