紅麻HcMS1基因的克隆、表達(dá)與功能分析

陳文濤，潘 根，唐慧娟，常 麗，李德芳，趙立寧，陳安國(guó)，李建軍

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 麻類研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410205)

紅麻(HibiscuscannabinusL.)是錦葵科木槿屬一年生纖維作物，具有抗旱、耐鹽堿、適應(yīng)性廣、生物量大等特性，在造紙、紡織、建筑材料、復(fù)合材料、水土保持、吸附劑、飼料、栽培基質(zhì)等方面有良好的應(yīng)用價(jià)值[1]，還可有效地緩解土壤重金屬污染問(wèn)題[2]。紅麻有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，雜交紅麻的韌皮纖維或生物產(chǎn)量可提高40%左右[3]。雄性不育是利用雜種優(yōu)勢(shì)的一條有效途徑，利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility)構(gòu)建三系配套進(jìn)行雜交制種可以免去人工去雄，同時(shí)提高雜交種子的純度[4]。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于紅麻雄性不育分子機(jī)理的研究工作已陸續(xù)開(kāi)展。趙艷紅[5]構(gòu)建紅麻線粒體atp9基因過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)在陽(yáng)性植株出現(xiàn)葉形、株高、花冠性狀異常且花藥不正常的現(xiàn)象，另外對(duì)線粒體基因atp9、atp6和atpA的RNA編輯研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)變的氨基酸大多以非極性氨基酸取代極性氨基酸。史奇奇[6]以紅麻不育系UG93A和保持系UG93B花藥為樣品，分別建立small RNA文庫(kù)，并使用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定42個(gè)保守miRNA和41個(gè)新的miRNA。韋范[7]通過(guò)乙?；鞍踪|(zhì)組學(xué)分析在UG93A和UG93B花藥中鑒定到56個(gè)乙?；揎棽町惖鞍?，并發(fā)現(xiàn)乙?；蛘{(diào)控GAPDH酶活力以及組蛋白乙?；{(diào)控了細(xì)胞質(zhì)雄性不育的發(fā)生。李增強(qiáng)等[8]通過(guò)研究紅麻不育系UG93A和保持系UG93B葉片和不同時(shí)期花藥基因組DNA甲基化情況，發(fā)現(xiàn)甲基化變化的基因在不育系和保持系之間的表達(dá)差異顯著，推測(cè)這些甲基化變化在雄性不育中發(fā)揮了重要的作用。錢(qián)景華、陳勵(lì)虹等[9-10]分別克隆紅麻轉(zhuǎn)錄因子MYB21基因和編碼生長(zhǎng)素受體的TIR1基因，分析基因表達(dá)模式并構(gòu)建了過(guò)表達(dá)載體和沉默載體。Chen等[11]通過(guò)對(duì)紅麻不育系、保持系的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)到838個(gè)顯著上調(diào)基因和528個(gè)顯著下調(diào)基因，并將其注釋到155個(gè)GO和74條KEGG代謝通路上。隨著對(duì)紅麻不育機(jī)理的研究增多，更多的不育基因得到挖掘，復(fù)雜的作用機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)逐漸清晰，將在紅麻生產(chǎn)實(shí)踐發(fā)揮重要的作用。

絨氈層參與花粉壁物質(zhì)合成，為小孢子發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)并適時(shí)地分泌胼胝質(zhì)酶以釋放小孢子，其在花藥發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用[12]。DYT1-TDF1-AMS-MS188-MS1遺傳途徑被證實(shí)調(diào)控?cái)M南芥絨氈層發(fā)育，其中DYT1、TDF1和AMS在絨氈層早期發(fā)育中起作用，而MS188和MS1在絨氈層晚期發(fā)育中起重要作用[13-14]。MS1是MS188的直接靶點(diǎn)，在調(diào)控?cái)M南芥孢子體花粉外殼蛋白基因的表達(dá)起關(guān)鍵作用[15]。MS1在擬南芥中編碼PHD-finger蛋白，在四分體期的絨氈層中表達(dá)，其突變體不能產(chǎn)生有活力的花粉，花粉在四分體釋放小孢子后不久退化，絨氈層也出現(xiàn)異?？张莼痆16]。本試驗(yàn)在前期紅麻不育系LC0301A和保持系LC0301B的花藥轉(zhuǎn)錄本中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)顯著差異表達(dá)的基因，其編碼蛋白序列與澳洲棉MS1蛋白有90%一致性、與擬南芥MS1蛋白有50%一致性，命名其為HcMS1基因。通過(guò)同源克隆的方法獲得了紅麻HcMS1基因，利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、保守域和親緣進(jìn)化關(guān)系等，通過(guò)qRT-PCR對(duì)紅麻不育系、保持系不同時(shí)期的花藥進(jìn)行表達(dá)量分析，并構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體對(duì)本氏煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，以驗(yàn)證HcMS1基因可能在紅麻不育中發(fā)揮一定的作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 試驗(yàn)所用紅麻品種不育系LC0301A和保持系LC0301B由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類所一年生創(chuàng)新育種團(tuán)隊(duì)提供，種植于麻類所長(zhǎng)沙創(chuàng)新試驗(yàn)基地。根據(jù)李建軍等[17]劃分紅麻花粉發(fā)育時(shí)期的標(biāo)準(zhǔn)，按照花蕾的大小分為4個(gè)時(shí)期：造孢細(xì)胞和小孢子母細(xì)胞至減數(shù)分裂時(shí)期為花蕾一期，四分體到單核期為花蕾二期，雙核期為花蕾三期，花粉成熟期為花蕾四期；取各時(shí)期花藥于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 試劑、載體與菌株 TRIzol液，DNAaseI，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaKaRa Ex Taq?DNA Polymerase，DNA回收試劑盒，pBLUE-T載體、Pcambia2301-ky過(guò)表達(dá)載體，T4DNA連接酶，各種相關(guān)限制性內(nèi)切酶購(gòu)于武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司。 SteadyPure 植物RNA提取試劑盒，Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑，SYBR Green qPCR試劑盒購(gòu)于湖南艾科瑞生物工程有限公司。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，農(nóng)桿菌菌株GV3101購(gòu)于長(zhǎng)沙天楚生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 以不育系LC0301A和保持系LC0301B的花藥為材料，采用TRIzol法提取紅麻總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性；采用TOYOBO公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Kit)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA以用于基因克隆。使用SteadyPure植物RNA提取試劑盒提取4個(gè)時(shí)期的不育系、保持系紅麻花藥RNA，使用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA用于qRT-PCR。

1.2.2 紅麻HcMS1基因的PCR擴(kuò)增及克隆 根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)，分析鑒定紅麻HcMS1基因轉(zhuǎn)錄本，利用NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder /)的Open Reading Frame Finder找出紅麻HcMS1的開(kāi)放閱讀框。用此序列在Primer 6.0軟件中設(shè)計(jì)特異性克隆引物(表1)，以紅麻花蕾cDNA為模板，使用Taq酶擴(kuò)增HcMS1基因的CDS序列，擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶連接到pBLUE-T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，37 ℃，100 mg/L氨芐青霉素LB培養(yǎng)基上抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

表1 引物序列Tab.1 Primers sequence

1.2.3 生物信息學(xué)分析 Prot Param(https：//web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；ProtScale(https：//web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的親疏水性；TMHMM Server v.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域；SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析蛋白質(zhì)是否含有信號(hào)肽；ProtComp 9.0進(jìn)行亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析；Inter-Pro(http：//www.ebi.ac.uk/interpro/)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；SOPMA 分析和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；Phyre2分析預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)；MEGA 7.0 軟件構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)HcMS1序列設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1)，以紅麻GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因(表1)，以不同樣品反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板。反應(yīng)體系為20 μL，包含1 μL 模板，10 μL 2×SYBR Premix、10 μmol/L上游引物和下游引物各0.4 μL、滅菌水補(bǔ)足20 μL。定量在BioRad CFX96 qPCR儀進(jìn)行，程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行熔解曲線分析，以確定引物的特異性?；蛳鄬?duì)表達(dá)量采用公式2-ΔΔCt計(jì)算，使用SPSS 21進(jìn)行單因素方差分析，利用Origin 9進(jìn)行繪圖。

1.2.5HcMS1基因過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化 根據(jù)HcMS1基因的ORF序列信息，選用SacⅠ/BamH Ⅰ內(nèi)切酶為酶切位點(diǎn)并設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物序列為MS1-F2/R2(表1)，以TA克隆為模板進(jìn)行HcMS1基因的PCR擴(kuò)增克隆。SacⅠ/BamH Ⅰ雙酶切pcambia2301-ky載體和HcMS1目的基因，回收HcMS1片段和pcambia2301-ky載體，進(jìn)行連接反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌并在50 mg/L卡那霉素(Kana)和50 mg/L利福平(Rif)抗性平板上進(jìn)行篩選，挑取單克隆菌落過(guò)夜搖菌并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，將PCR陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為35S-F /2301-F(表1)。將測(cè)序后比對(duì)成功的過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒，采用凍融法轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌并在50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平抗性平板上28 ℃進(jìn)行篩選，挑取單克隆菌落180 r/min過(guò)夜搖菌15 h，加入等量60%甘油于-80 ℃超低溫保存待用。

本氏煙草轉(zhuǎn)化試驗(yàn)參考王會(huì)強(qiáng)[18]葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草的方法。切取無(wú)菌培養(yǎng)的煙草葉片預(yù)培養(yǎng)2 d；農(nóng)桿菌侵染液濃度(OD600)為0.5，侵染時(shí)間為5～8 min；煙草葉片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)最佳時(shí)間為2 d。各時(shí)期培養(yǎng)基配方為：預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+1 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA)，分生培養(yǎng)基(MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+50 mg/L Kana+500 mg/L Cef)，生根培養(yǎng)基(MS+0.25 mg/L NAA+50 mg/L Kana+500 mg/L Cef)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HcMS1基因的克隆

TRIzol法提取RNA后取500 ng進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA用于后續(xù)試驗(yàn)。以上述cDNA為模板擴(kuò)增目的基因HcMS1，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖1-A)，擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段大小一致且無(wú)雜帶。將擴(kuò)增PCR產(chǎn)物切膠回收后克隆到T載體上，藍(lán)白斑篩選后進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖1-B)顯示，在2 000 bp處有明顯的目的條帶，且無(wú)特異性擴(kuò)增。分別取2個(gè)菌落PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，將測(cè)序結(jié)果與原始參考序列進(jìn)行比對(duì)，HcMS1基因比對(duì)結(jié)果(圖2)顯示，測(cè)序結(jié)果和參考序列比對(duì)結(jié)果一致，克隆成功。

2.2 HcMS1基因的生物信息學(xué)分析

利用Prot Param網(wǎng)站，對(duì)紅麻HcMS1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：HcMS1基因序列開(kāi)放閱讀框(ORF)為1 950 bp，共編碼氨基酸數(shù)649，包含20種常見(jiàn)氨基酸(表2)，原子總數(shù)10 279，分子量73.566 72 ku，分子式為C3270H5118N910O938S43，由于含有43個(gè)硫原子，故蛋白中可能存在二硫鍵。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)為76，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)為79，理論pI為7.89。HcMS1蛋白的不穩(wěn)定性指數(shù)為30.80，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)；脂肪指數(shù)為86.30，親水性指數(shù)平均值(GRAVY)為-0.221，更偏向?yàn)橛H水蛋白。

表2 HcMS1編碼氨基酸組成Tab.2 The amino acid composition encoded by HcMS1

2.2.1 親疏水性分析、跨膜結(jié)構(gòu)域及高級(jí)結(jié)構(gòu)分析 通過(guò)ProtScale在線分析蛋白親疏水性(圖3-A)，在第16位氨基酸出現(xiàn)最低值-3.411，親水性最強(qiáng)，在第80位氨基酸出現(xiàn)最高值2.444，疏水性最強(qiáng)。整體看疏水氨基酸和親水氨基酸分布較均勻，偏向?yàn)橛H水蛋白。利用TMHMM在線分析HcMS1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3-B)，HcMS1蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域，推測(cè)為膜外蛋白。

利用SOPMA預(yù)測(cè)HcMS1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4-A)，HcMS1蛋白由α-螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲組成，分別占整個(gè)肽鏈的37.90%，15.87%，3.85%，42.37%。利用Phyre2模擬HcMS1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。建模過(guò)程中共搜索1 000條序列與目的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，報(bào)告單按照置信度大小列出前120條序列模型，并以99.0%置信度，10%序列長(zhǎng)度覆蓋度的d1weea(FYVE/PHD zinc finger)蛋白為參考建立模型(圖4-B)。

2.2.2 信號(hào)肽、結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位分析 通過(guò)SignalP-5.0 Server分析(圖5-A)，N端前70位氨基酸殘基，存在信號(hào)肽的概率幾乎為零，故推測(cè)HcMS1蛋白沒(méi)有信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。利用Inter-Pro在線分析(圖5-B)，HcMS1蛋白預(yù)測(cè)到多個(gè)結(jié)構(gòu)域(591-641位Znf-PHD-finger、594-640位PHD、593-639位Znf-PHD)，同源性超家族(590-644位Znf-FYVE-PHD、576-643位Znf-RING/FYVE/PHD)和保守序列(594-638位Zinc-finger-PHD-type-CS)。ProtComp 9.0分析HcMS1蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核。

第一行是TA隆測(cè)序序列；第二行是參考序列。First line is reference sequence；The second is sequencing sequence.

圖3 親疏水性分析、跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Hydrophobicity analysis，transmembrane domain analysis

圖4 二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of secondary，tertiary structure

圖5 信號(hào)肽、結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Signal peptide and domain analysis

2.2.3 進(jìn)化樹(shù)分析 在NCBI的BlastP中輸入HcMS1蛋白序列，在non-redundant protein sequences庫(kù)中搜索，獲得多個(gè)物種的同源蛋白并下載靠前的20個(gè)物種MS1蛋白序列，其中包括：陸地棉(Gossypiumhirsutum)、榴蓮(Duriozibethinus)、木槿(Hibiscussyriacus)、百花鶴望蘭(Herraniaumbratica)、栓皮櫟(Quercussuber)、蓖麻(Ricinuscommunis)、巴西橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)、番木瓜(Caricapapaya)、毛果楊(Populustrichocarpa) 、山茶花(Camelliasinensis)、桑樹(shù)(Morellarubra)、木薯(Manihotesculenta) 、大麻(Cannabissativa)、甜櫻桃(Prunusavium)、葡萄(Vitisvinifera)、相思子(Abrusprecatorius)、鷹嘴豆(Cicerarietinum)、月季(Rosachinensis)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、大豆 (Glycinemax)。利用MEGA 7.0軟件，采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。分析構(gòu)建結(jié)果(圖6)，其中陸地棉MS1蛋白與紅麻HcMS1蛋白進(jìn)化關(guān)系最近，其次為木槿。

2.3 HcMS1表達(dá)模式分析

不同時(shí)期HcMS1表達(dá)模式分析顯示(圖7)，在不育系和保持系的紅麻花藥中，HcMS1的表達(dá)隨著花蕾的發(fā)育均呈現(xiàn)先升高、后下降的趨勢(shì)，其在二期表達(dá)量最高，其次是三期，在四期的表達(dá)量最低，相對(duì)表達(dá)量?jī)H為0.1，0.01。比較不育系與保持系發(fā)現(xiàn)，保持系二期相對(duì)表達(dá)量為90.35，是不育系二期表達(dá)量的2.5倍，在P值0.05水平下呈現(xiàn)顯著差異。在保持系中，HcMS1于二期表達(dá)量超高，而在其他時(shí)期均為極低的表達(dá)水平，這與擬南芥MS1僅在小孢子釋放期表達(dá)事實(shí)相吻合；相比保持系，不育系HcMS1表達(dá)周期較長(zhǎng)，在二期、三期均有相對(duì)較高的表達(dá)量，且在一期、四期表達(dá)水平均高于保持系。

圖6 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.6 phylogenetic tree

圖7 HcMS1在不育系、保持系不同時(shí)期表達(dá)模式Fig.7 Expression pattern of HcMS1 in different stages of male sterile line and maintainer line

2.4 HcMS1基因過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建和煙草轉(zhuǎn)化

2.4.1 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建 將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在2 000 bp處有明顯目的條帶(圖8)。取PCR陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)結(jié)果顯示目的基因序列與參考序列一致，表示過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖9)。

2.4.2 遺傳轉(zhuǎn)化 圖中培養(yǎng)基無(wú)污染、苗狀態(tài)健康(圖10-A)。將生根的煙草組培苗經(jīng)煉苗后移植到滅菌土中繼續(xù)培養(yǎng)，提取野生型煙草和轉(zhuǎn)化煙草的新鮮葉片DNA，使用測(cè)序引物35S-F/2301-F(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段，電泳后對(duì)比野生型發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化煙草在2 000 bp處有目的條帶，證明HcMS1轉(zhuǎn)化成功(圖10-B)，對(duì)煙草成熟期觀察發(fā)現(xiàn)：野生型煙草株型較高，可以正常結(jié)實(shí)，6片花萼大小均勻，花柱較長(zhǎng)，果實(shí)大且飽滿；而轉(zhuǎn)基因煙草株型較矮，無(wú)法正常結(jié)實(shí)，6片花萼大小不一，花柱短小，兩者對(duì)比有明顯的差異(圖11)。表明通過(guò)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化獲得的HcMS1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因本氏煙草無(wú)法正常自交結(jié)實(shí)，存在不育現(xiàn)象。

Marker長(zhǎng)度為2 000 bp。Marker′s length is 2 000 bp.

3 討論與結(jié)論

紅麻不育機(jī)理研究目前主要在細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)方面開(kāi)展工作。在細(xì)胞生物學(xué)方面，主要通過(guò)研究花藥不同發(fā)育時(shí)期絨氈層和各組織化學(xué)成分變化，來(lái)確定花S藥敗育時(shí)期。大量研究表明，花藥絨氈層發(fā)育異常是花粉敗育的重要細(xì)胞學(xué)原因。朱麗梅等[19]對(duì)紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系L23A和K03A的小孢子敗育過(guò)程進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)其敗育發(fā)生在四分體及單核小孢子時(shí)期。一年生麻類作物創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)在前期已通過(guò)對(duì)不育系LC0301A和保持系LC0301B不同時(shí)期的花藥細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，不育系發(fā)生敗育的主要時(shí)期為單核期，單核期不育系的絨氈層退化嚴(yán)重，小孢子出現(xiàn)畸形，不能形成正常的花粉粒[17]。

MS1基因編碼PHD轉(zhuǎn)錄因子并參與調(diào)控花粉和絨氈層發(fā)育。目前MS1基因的功能在擬南芥中研究比較詳細(xì)，水稻、小麥等其他作物也相繼開(kāi)展MS1基因的挖掘與分析工作。關(guān)于擬南芥的MS1基因的研究，早在21世紀(jì)初始便積極展開(kāi)。Wilson等[16]在2001年報(bào)道：擬南芥MS1突變體的花粉在四分體釋放小孢子后不久即發(fā)生退化，絨氈層也出現(xiàn)空泡化；MS1在小孢子釋放期的絨氈層部位低水平表達(dá)，缺失基因會(huì)導(dǎo)致其編碼蛋白的提前終止和PHD-finger基序的丟失。Ito等[20]通過(guò)轉(zhuǎn)座子敲除擬南芥MS1基因，小孢子在四分體中分離出來(lái)即發(fā)生外層缺失；MS1基因僅在四分體的很短時(shí)期內(nèi)于絨氈層表達(dá)，并將MS1定位在細(xì)胞核上。2007年，Ito等[21]通過(guò)構(gòu)建MS1-SRDX融合結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化擬南芥揭示了MS1具有轉(zhuǎn)錄激活因子的功能，參與花粉外壁、花粉胞質(zhì)和絨氈層的發(fā)育。2006年，Vizcay-Barrena等[22]通過(guò)TUNEL染色和超微結(jié)構(gòu)分析，野生型絨氈層在小孢子有絲分裂Ⅰ后發(fā)生程序性細(xì)胞死亡(PCD)，而MS1突變體的絨氈層中未觀察到PCD的跡象。隨著人們認(rèn)識(shí)到MS1基因?qū)φ{(diào)控?cái)M南芥雄性不育的重要性，該基因的挖掘開(kāi)發(fā)也在別的作物上相繼展開(kāi)。2011年，Li等[23]在水稻中的報(bào)道了一個(gè)擬南芥MS1同源基因PTC1，該基因編碼PHD-finger蛋白，控制絨氈層程序化發(fā)育和功能性花粉的形成，其突變體的絨氈層發(fā)生增殖失控和壞死樣死亡。2017年，Wang等[24]在小麥中克隆并鑒定MS1基因，其在小孢子母細(xì)胞中特異性表達(dá)，編碼的蛋白定位于質(zhì)體和線粒體膜，具有磷脂酶結(jié)合活性；Tucker等[25]發(fā)現(xiàn)小麥ms1可完全恢復(fù)了ms1d突變體的育性，編碼一種花粉外壁發(fā)育所必需的糖基磷脂酰肌醇錨定的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白。本試驗(yàn)從紅麻不育系和保持系的花藥中克隆出一個(gè)與擬南芥MS1基因相似度較大的同源基因HcMS1，前期通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)的手段發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致不育系花粉敗育的原因在于絨氈層PCD異常，絨氈層退化嚴(yán)重且提前，這與擬南芥中報(bào)道的MS1調(diào)控絨氈層PCD發(fā)育相似；同時(shí)通過(guò)qRT-PCR發(fā)現(xiàn)HcMS1花蕾二期的表達(dá)量在保持系中顯著高于不育系，且在保持系中該基因幾乎只在花蕾二期高度表達(dá)，這又與擬南芥MS1表達(dá)模式相符合，另外相比保持系，不育系在較長(zhǎng)時(shí)間都保持著較高水平的表達(dá)，推測(cè)HcMS1表達(dá)時(shí)期的紊亂也可能是導(dǎo)致紅麻不育的原因之一。綜合以上，推測(cè)HcMS1基因在調(diào)控紅麻雄性不育的過(guò)程中亦發(fā)揮著一定的作用。

第1行是參考序列；第2行是測(cè)序序列。First line is reference sequence；The second is sequencing sequence.

Marker長(zhǎng)度為2 000 bp；+. 質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；-. 無(wú)DNA陰性對(duì)照；WT. 野生型；HcMS1.轉(zhuǎn)基因煙草。Marker length is 2 000 bp； + . Plasmid positive control；-. Non-DNA negative control；WT. Wild type； HcMS1.Transgenic tobacco.

MS1. PCR鑒定陽(yáng)性煙草；WT. 野生型煙草。MS1. PCR positive tobacco; WT. Wild type.

唐文武等[26]以擬南芥花粉發(fā)育關(guān)鍵基因MS1為參考序列，通過(guò)Blast比對(duì)獲得蕓薹屬作物同源基因序列，運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)其編碼氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，為作物雜種優(yōu)勢(shì)利用提供理論參考。高嵩等[27]同源克隆玉米ZmUdtl基因并利用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)蛋白性質(zhì)、結(jié)構(gòu)等，為后期的克隆和功能鑒定奠定基礎(chǔ)。為了預(yù)測(cè)HcMS1基因的結(jié)構(gòu)功能，挖掘基因潛在信息，本試驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)HcMS1蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果顯示，該蛋白為親水蛋白，沒(méi)有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，存在典型的PHD-finger結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域廣泛存在于雄性不育基因MS1編碼蛋白中；其亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核上，推斷HcMS1蛋白可能作為轉(zhuǎn)錄因子，作用于細(xì)胞核上，調(diào)控與育性相關(guān)的基因表達(dá)。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，紅麻HcMS1蛋白與陸地棉MS1蛋白親緣關(guān)系最近。

煙草作為一種模式植物，其轉(zhuǎn)基因體系已相當(dāng)成熟，目前有很多在煙草上進(jìn)行異源表達(dá)的研究，且大都獲得了與研究目的有關(guān)聯(lián)的價(jià)值性狀[28-29]。試驗(yàn)通過(guò)本氏煙草遺傳轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)，35S強(qiáng)啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)HcMS1基因在陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草中表現(xiàn)為植株矮化、花萼變小且大小不均、花柱縮短、無(wú)法結(jié)實(shí)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)HcMS1基因有影響本氏煙草正常育性的功能，為驗(yàn)證HcMS1是調(diào)控紅麻雄性不育的關(guān)鍵基因提供了有力的支撐。

總之，本研究利用同源克隆方法在紅麻花藥中克隆出HcMS1基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)HcMS1蛋白有顯著的PHD結(jié)構(gòu)保守域，其亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核上，很有可能以轉(zhuǎn)錄因子的形式調(diào)控育性基因的表達(dá)。此外，qRT-PCR結(jié)果顯示，HcMS1基因在紅麻保持系花蕾的四分體至單核期高量表達(dá)，符合擬南芥MS1基因表達(dá)模式。最后，通過(guò)本氏煙草遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，在獲得的HcMS1過(guò)表達(dá)本氏煙草上發(fā)現(xiàn)了顯著的不結(jié)實(shí)現(xiàn)象。本研究克隆出紅麻HcMS1基因，并結(jié)合生物信息學(xué)、基因表達(dá)和煙草轉(zhuǎn)化對(duì)其進(jìn)行分析，為挖掘紅麻不育調(diào)控基因提供了一定信息資源，為日后該基因的深度功能解析做好了鋪墊。