葡萄灰霉病病原菌鑒定及天然藥物的抑制效果評(píng)價(jià)

張威，周勇,2,3*，彭言劼,2,3，劉忠,2,3，鄭英

（1. 樂(lè)山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川樂(lè)山 614000；2. 樂(lè)山師范學(xué)院峨眉山研究院，四川樂(lè)山 614000；3. 峨眉山生物多樣性保護(hù)與利用研究所，四川樂(lè)山 614000；4. 樂(lè)山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川樂(lè)山 614000）

葡萄是世界四大水果之一，在我國(guó)具有悠久的種植歷史，且總產(chǎn)量位于世界首位[1]。我國(guó)南方地區(qū)日照充足，雨量充沛，在鮮食葡萄生產(chǎn)中具有顯著的地域優(yōu)勢(shì)。四川盆地作為南方葡萄的主要產(chǎn)區(qū)，在鮮食葡萄生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。但四川盆地高溫高濕的氣候環(huán)境易誘發(fā)葡萄病蟲(chóng)害的發(fā)生[2]，其中灰霉病是威脅葡萄生產(chǎn)的主要病害之一[3]。葡萄灰霉病病原菌為葡萄孢屬真菌，其侵染植株后，引起植株體細(xì)胞程序性死亡，從而破壞組織正常生長(zhǎng)，屬于植物致病的死體營(yíng)養(yǎng)型病原真菌類型[4]。早期報(bào)道的葡萄孢屬真菌只有Botrytis cinereaPers，近年來(lái)又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)能侵染葡萄的致病新種Botrytissp.2[5]、Botrytis pseudocinerea[6]、Botrytis sinoviticola[7]和Botrytissp. B83[8]。這些葡萄孢屬新種在形態(tài)學(xué)上存在一定差異，并且對(duì)不同葡萄品種的致病力分化嚴(yán)重，感病品種發(fā)病常會(huì)造成大幅減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。

生產(chǎn)上對(duì)葡萄灰霉病的防治大多采用化學(xué)藥劑方法[9]，易造成農(nóng)殘超標(biāo)和環(huán)境污染，且化學(xué)藥劑的作用機(jī)理單一，防治效果不理想等。據(jù)報(bào)道，目前已發(fā)現(xiàn)灰霉病病原菌對(duì)多菌靈、甲基托布津、腐霉利、異菌脲、咯菌腈、啶酰菌胺等殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗性，且部分能穩(wěn)定遺傳，甚至出現(xiàn)了多重抗藥性或防效接近喪失的情況[10-16]。因此，研發(fā)高效、廣譜、抗性持久、環(huán)境友好的殺菌劑是葡萄灰霉病防治中亟須解決的重要問(wèn)題[17]。近年來(lái)，生物源農(nóng)藥因其環(huán)境友好、殺菌譜廣、不易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于植物病蟲(chóng)害防治。其中，植物源農(nóng)藥在病害防控方面的優(yōu)勢(shì)正日益受到人們的廣泛重視。目前已發(fā)現(xiàn)藥用植物飛廉、石菖蒲、冬凌草、黃連、黃芩等[18-21]的提取物和紅蓼揮發(fā)油[22]可有效防治黃瓜枯萎病、番茄灰霉病、蘋果青霉病、魔芋軟腐病、馬鈴薯環(huán)腐病等多種植物病害，但在利用植物源制劑對(duì)葡萄灰霉病防治方面鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究對(duì)四川成都葡萄產(chǎn)區(qū)田間灰霉病病原菌進(jìn)行分離和鑒定，并探究了該病原菌對(duì)11個(gè)葡萄品種的致病力，同時(shí)利用藥用植物提取液對(duì)葡萄灰霉病病原菌進(jìn)行抑菌研究，旨在為該區(qū)域葡萄品種的產(chǎn)業(yè)布局、病害防治和天然藥物開(kāi)發(fā)等提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

葡萄灰霉病病原菌采自四川成都葡萄產(chǎn)區(qū)（雙流）灰霉病染病葡萄植株。用于灰霉病病原菌致病力鑒定的11個(gè)葡萄品種為‘巨峰’‘夏黑’‘巨玫瑰’‘陽(yáng)光玫瑰’‘維多利亞’‘黑巴拉多’‘美人指’‘寒香蜜’‘醉金香’‘紫甜’‘SO4’，采自四川省樂(lè)山市夾江縣葡萄產(chǎn)區(qū)。

供試藥材防己、苦地丁、金銀花、海金沙、藿香、鉤藤、黃連、黃苓、丁香、細(xì)辛、柴胡、荊芥、肉桂、小茴香、蒼術(shù)、艾葉、辛夷、石榴皮、蛇床子、厚樸、千里香、金櫻子、石菖蒲、大黃、苦參、青蒿，共26種，采購(gòu)于樂(lè)山德盛堂大藥房和文澤軒中藥材店。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離及形態(tài)學(xué)觀察

采集四川成都雙流葡萄產(chǎn)區(qū)內(nèi)6個(gè)種植基地表現(xiàn)典型灰霉病癥狀的葡萄果穗，用無(wú)菌保鮮袋密封后帶回實(shí)驗(yàn)室?；颐共〔≡姆蛛x、純化、培養(yǎng)參考方中達(dá)[23]的方法；再將病原菌菌株沿菌落邊緣打取菌餅（直徑5 mm）倒置轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基，黑暗恒溫20 ℃培養(yǎng)，逐日觀察記錄分生孢子梗、分生孢子、菌核的形態(tài)特征。

1.2.2 葡萄灰霉病病原菌致病力檢測(cè)

病原菌致病性檢測(cè)參考離體葉片接種法[24]。2021年4月，采取供試品種當(dāng)年生枝條上第3～5片成齡葉片，每品種選取3片葉，用無(wú)菌水清洗3次后擦干，置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的150 mm培養(yǎng)皿中，用針刺法在葉片中間接種部位制造3處傷口（避開(kāi)葉片的主脈刺傷），取培養(yǎng)3 d的菌餅（直徑5 mm）接種于離體葉片正面的傷口部位，以接種空白瓊脂塊為對(duì)照，每個(gè)葉片接種3處，同時(shí)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。置于條件為20 ℃、100%相對(duì)濕度、16 h光照、8 h暗光的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在接種后第3天和第6天統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，用十字交叉法測(cè)量病斑直徑。并對(duì)發(fā)病葉片再次進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。

1.2.3 病原菌的SCAR標(biāo)記檢測(cè)

病原菌采用T5 Direct PCR Kit (Plus)（北京擎科）進(jìn)行直接擴(kuò)增，SCAR標(biāo)記檢測(cè)參考范璇[25]的方法，特異性引物（北京擎科）序列如表1所示。PCR擴(kuò)增體系50 μL：包含DNA模板2 μL，2×T5 Direct PCR Mix(Plus)；上下游引物各2 μL（10 μmol/L）；最后用ddH2O補(bǔ)充至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，56.7 ℃/59 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共37個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，TS-GelRed核酸染料（北京擎科）進(jìn)行染色，凝膠成像。

表1 葡萄灰霉病病原菌分子鑒定所用SCAR引物Table 1 SCAR primers for molecular identification of pathogen of grey mold in grapes

1.2.4 中草藥提取液的制備

將26種中草藥分別磨碎，各稱取10 g，用80%乙醇50 mL浸泡，35 ℃、150 r/min恒溫振蕩提取48 h后，室溫下4000 r/min離心6 min，提取母液，于5 ℃暗處儲(chǔ)存?zhèn)溆?。最終中草藥浸提液的濃度為200 mg/mL[26]，并計(jì)算提取效率。

提取效率（mL/g）＝提取母液量/稱取中藥材的量[21]

1.2.5 醇提物抑菌活性的測(cè)定

用接種環(huán)將培養(yǎng)3 d的菌株轉(zhuǎn)移至試管中，加入無(wú)菌水，稀釋成濃度為1×105cfu/mL的菌液。抑菌活性采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行測(cè)定[27]，即移取150 μL菌液，用涂布器將其均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，再在培養(yǎng)基上打3個(gè)孔，孔徑為85 mm，將中藥提取物注入孔中，加滿且不得溢出。以80%乙醇作為對(duì)照（CK），每組重復(fù)3次。將培養(yǎng)皿置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量記錄抑菌圈直徑。

1.2.6 醇提物MIC值及EC50值測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行測(cè)定[28]。選取抑菌效果最佳的2種植物提取物，采用二倍稀釋法依次將其稀釋為最終濃度16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0 mg/mL的含藥平板，每組接種一塊直徑5 mm的菌餅，每組重復(fù)3次，置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。用十字交叉法測(cè)菌落直徑，菌絲不生長(zhǎng)的最低濃度為提取物對(duì)病原菌的最低抑菌濃度（MIC）。計(jì)算不同時(shí)間（48 h/72 h）的抑制率，在DPS軟件中求出毒力回歸方程（y＝a＋bx）、抑制中濃度EC50以及相關(guān)系數(shù)。

抑菌率＝(對(duì)照組菌落直徑－處理組菌落直徑)/(對(duì)照組菌落直徑－菌餅直徑)×100%

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理用Excel 2010，顯著性檢驗(yàn)在DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中進(jìn)行，多重比較用Duncan's新復(fù)極差法（SSR法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)觀察及鑒定

在PDA培養(yǎng)基上，葡萄灰霉病病原菌落形態(tài)呈絮狀，形成大量氣生菌絲。隨培養(yǎng)天數(shù)增加，菌絲由白色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榛液稚?，后期形成不?guī)則狀的黑褐色菌核，主要分布于培養(yǎng)皿邊緣?；移咸焰叻稚咦庸＜舛顺什粚?duì)稱分叉，末端膨大，著生無(wú)色至淺褐色的分生孢子，孢子呈橢圓形或卵形，成熟后似葡萄穗狀。菌絲自分生孢子梗處延續(xù)生長(zhǎng)，可成串。

將分離所得灰霉菌菌株用刺傷接種法接種到新鮮健康的葡萄葉片上，6 d后可觀察到接種部位出現(xiàn)淡黃褐色“V”字病斑，病斑邊緣不規(guī)則，表面生有少量霉?fàn)钗?，發(fā)病癥狀與田間自然條件下一致。再對(duì)發(fā)病的葡萄葉片進(jìn)行病原菌取樣再分離，所得菌株形態(tài)與原接種菌落形態(tài)相同，由柯赫氏法則確定分離的菌株為葡萄灰霉病病原菌。

利用SCAR標(biāo)記對(duì)分離的葡萄灰霉病病原菌進(jìn)行檢測(cè)，引物ITS-1/ITS-4、Bc-f/Bc-r、Bps-f/Bps-r、Bsa-f/Bsa-r、Bsp2-f/Bsp2-r檢測(cè)所分離的菌株，只有真菌通用性引物ITS-1/ITS-4和Bc-f/Bc-r引物擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，且片段與預(yù)期大小一致，其它引物未擴(kuò)增出任何片段。結(jié)合病原菌的菌落形態(tài)特征和SCAR標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果，確定在四川成都葡萄產(chǎn)區(qū)所分離到的葡萄灰霉病病原菌均為灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。

圖1 葡萄灰霉病病原菌的形態(tài)及鑒定Figure 1 Morphology and identification of pathogens of grey mold in grape

2.2 致病力鑒定

將灰葡萄孢離體接種不同品種新鮮葡萄葉片，依據(jù)葉片上所形成的病斑大小來(lái)判斷該菌株的致病力強(qiáng)弱。如表2所示，該菌種對(duì)不同葡萄品種的致病力存在差異。在第3天，該菌種對(duì)‘黑巴拉多’葡萄致病力最強(qiáng)，平均病斑直徑為8.233 mm，極顯著強(qiáng)于其它品種；其次是‘寒香蜜’‘SO4’‘紫甜’‘維多利亞’‘陽(yáng)光玫瑰’，平均病斑為6.144～6.833 mm。該病原菌對(duì)以上5個(gè)品種致病力無(wú)顯著差異，但極顯著強(qiáng)于‘巨峰’‘美人指’和‘醉金香’；而對(duì)‘夏黑’和‘巨玫瑰’無(wú)明顯致病效果。在第6天，該菌種對(duì)‘黑巴拉多’‘紫甜’‘寒香蜜’‘SO4’和‘陽(yáng)光玫瑰’致病力較強(qiáng)，病斑直徑為7.267～9.500 mm，均極顯著強(qiáng)于其它品種；其次是‘維多利亞’‘美人指’‘巨峰’‘醉金香’和‘夏黑’，對(duì)這5種品種的致病力顯著強(qiáng)于‘巨玫瑰’；而對(duì)‘巨玫瑰’無(wú)明顯致病性。

表2 灰葡萄孢菌對(duì)11個(gè)葡萄品種的致病力比較Table 2 Comparison of pathogenicity of Botrytis cinerea against 11 grape varieties mm

2.3 中藥提取物對(duì)灰葡萄孢的抑制效果

不同植物提取物對(duì)灰葡萄孢抑菌效果差別較大，如表3所示。其中，有8種植物具有較強(qiáng)的抑菌活性，其中丁香、厚樸醇提物抑菌效果最好，平均抑菌圈直徑分別為49.50、46.07 mm，極顯著優(yōu)于其它中藥醇提物及對(duì)照；黃連和穿心蓮醇提物效果次之，平均抑菌圈為20.70、17.57 mm，二者存在顯著差異，但均極顯著優(yōu)于其它中藥醇提物及對(duì)照；辛夷花、石菖蒲、大黃、金櫻子醇提物抑菌效果差異不顯著，均有較強(qiáng)抑菌效果；而苦地丁、荊芥、防己、小茴香醇提物對(duì)灰葡萄孢無(wú)明顯抑制作用。從提取率看，2種具有最好抑菌效果的藥材丁香、厚樸同時(shí)具有較高的提取率，為2.87～3.18 mL/g，經(jīng)濟(jì)性較好。

表3 26種中藥醇提取物對(duì)灰葡萄孢的抑制作用Table 3 Inhibitory effects of alcohol extractions of 26 Chinese herbs on Botrytis cinerea

2.4 丁香、厚樸梯度濃度醇提物對(duì)灰葡萄孢的抑制效果

選取濃度梯度為2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL的帶藥培養(yǎng)基，在48 h和72 h的菌絲生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別求出MIC值、毒力回歸方程和抑制中濃度（EC50），結(jié)果見(jiàn)表4。在48 h時(shí)，丁香和厚樸對(duì)灰葡萄孢的EC50分別為0.218、0.420 mg/mL，MIC值分別為2、8；而72 h時(shí)，EC50分別為0.291、0.741 mg/mL，MIC值分別為2、16 mg/mL，因此丁香稀釋后藥效保持度優(yōu)于厚樸，經(jīng)濟(jì)效益較高。兩種中藥醇提物在48 h作用于灰葡萄孢菌絲的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖2。

表4 丁香、厚樸醇提物對(duì)灰葡萄孢的毒力方程及MIC值Table 4 Toxicity equation and MIC of alcohol extractions of Clove and Magnolia to Botrytis cinerea

圖2 丁香、厚樸梯度濃度醇提物對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)的影響（48h）Figure 2 Effects of alcohol extractions of clove and magnolia officinalis at gradient concentration on mycelial growth of Botrytis cinerea（48h）

3 討論

該研究根據(jù)柯赫氏法則、病原菌菌絲和菌核形態(tài)特征及SCAR標(biāo)記檢測(cè)，對(duì)四川成都葡萄產(chǎn)區(qū)灰霉病病原菌進(jìn)行了鑒定，確定所分離到的灰霉病病原菌為灰葡萄孢（Botrytis cinerea）?；移咸焰吒詮?qiáng)，寄主范圍廣，已報(bào)道的寄主就有235種[29]，且致病力差異大。Egashira等[29-30]發(fā)現(xiàn)，灰霉菌對(duì)栽培種番茄的致病力強(qiáng)于野生種，且隨著植株年齡的增大致病力增強(qiáng)，對(duì)同一植株的葉片致病力隨葉齡的增大而增強(qiáng)?？芎赀_(dá)等[31]發(fā)現(xiàn)，不同菌株對(duì)同一葡萄品種的致病力不同，對(duì)不同葡萄品種的致病力也不同。本試驗(yàn)對(duì)11個(gè)不同品種葡萄葉片進(jìn)行致病力測(cè)定發(fā)現(xiàn)，該灰霉病病原菌菌株對(duì)不同葡萄品種的致病力差異較大，‘巨玫瑰’和‘夏黑’對(duì)葡萄灰霉病的抗性較強(qiáng)，‘黑巴拉多’則易感，因此對(duì)于‘黑巴拉多’的種植應(yīng)做好清園工作，且在發(fā)芽前采取預(yù)防措施；部分品種第3天和第6天平均病斑直徑差異較大，這可能是不同品種葡萄對(duì)該灰霉病病原菌的抗性呈一定階段性，即可能在病程不同階段葉片內(nèi)含物含量變化或分生孢子大量繁殖，導(dǎo)致抗性發(fā)生變化或致病力增強(qiáng)，因此對(duì)于‘維多利亞’‘寒香蜜’‘黑巴拉多’品種，若發(fā)現(xiàn)感病，應(yīng)在初期及時(shí)進(jìn)行防治，清除病葉和病穗，以防止病情蔓延。

灰霉病菌是一機(jī)會(huì)病原菌，作物種質(zhì)資源中尚未發(fā)現(xiàn)抗病的材料，很難培育出抗病品種[32]。天然中藥材具有普通化學(xué)藥劑所不具備的高效抗菌、安全、無(wú)殘留等特點(diǎn)，能解決病原菌耐藥性、環(huán)境污染和農(nóng)殘等問(wèn)題。本研究測(cè)定了26種中藥醇提物對(duì)灰葡萄孢的抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丁香、厚樸醇提物對(duì)灰葡萄孢具有極顯著的抑菌作用，其平均抑菌圈直徑分別為49.50、46.07 mm，48 h的EC50分別為0.218、0.420 mg/mL，且具有較高的提取效率（2.87～3.18 mg/mL），可作為制備防治葡萄灰霉病的植物源農(nóng)藥材料。

本研究中的抑菌試驗(yàn)僅限于26種中藥醇提物，有些中藥抑菌效果較差，可能是乙醇對(duì)中藥中有效成分提取有限，需選擇多種溶劑進(jìn)行提取進(jìn)一步確認(rèn)；丁香、厚樸醇提物對(duì)灰葡萄孢抑菌效果較好，但尚不知其對(duì)葡萄生長(zhǎng)的生理指標(biāo)是否有影響；并且灰葡萄孢的致病力檢測(cè)均在離體條件下測(cè)定，未進(jìn)行田間活體試驗(yàn)。因此，更準(zhǔn)確的結(jié)果需要擴(kuò)大中藥品種篩選范圍，選出高效準(zhǔn)確提取中藥活性物質(zhì)的方式，在田間進(jìn)行活體致病力檢測(cè)和抑菌試驗(yàn)。