新加香薷飲揮發(fā)油氣相色譜指紋圖譜研究

鑒志剛，葉世蕓*，李向東，王敏（.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽 55000；.貴州得軒堂護(hù)康藥業(yè)股份有限公司，貴陽 550008）

新加香薷飲記載于清代醫(yī)家吳鞠通所著《溫病條辯》[1]，由香薷（二錢）、銀花（三錢）、鮮扁豆花（三錢）、厚樸（二錢）、連翹（二錢）等5 味中藥組成，香薷發(fā)汗解表，和中利濕，有“夏月麻黃”之稱，為夏月解表祛暑要藥，金銀花、連翹均味辛涼而質(zhì)輕清，有輕以去實(shí)，清熱解毒之功；白扁豆花能健脾化濕以和中，辛涼宣散，增強(qiáng)香薷清透暑熱之力；厚樸苦辛性溫，燥濕化滯，行氣消悶，助香薷理氣化濕。諸藥相合，共奏祛暑解表，清熱化濕之功。臨床應(yīng)用主要集中在夏季暑濕型感冒、發(fā)熱、中暑等疾病[2-4]，是用于祛濕解表的經(jīng)典名方，已經(jīng)收錄于國(guó)家中醫(yī)藥管理局2018 發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中。

近幾年來，國(guó)家連續(xù)發(fā)布關(guān)于經(jīng)典名方的相關(guān)政策，質(zhì)量控制方面要求更加嚴(yán)格，而指紋圖譜是中藥質(zhì)量控制方面常用重要手段[5]，目前新加香薷飲相關(guān)報(bào)道多集中在其臨床應(yīng)用方面，在質(zhì)量控制方面僅謝佳佳等[6]建立了新加香薷飲標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC指紋圖譜，可見相關(guān)研究薄弱，同時(shí)缺少對(duì)方中揮發(fā)性成分的相關(guān)研究，無法全面地對(duì)新加香薷飲進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，方中多種藥材含有揮發(fā)性成分，如香薷中麝香草酚、香荊芥酚是2020年版《中國(guó)藥典》控制香薷質(zhì)量的指標(biāo)性成分[7]，故本研究采用GC 法對(duì)16 批新加香薷飲的揮發(fā)性成分進(jìn)行指紋圖譜研究。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 7890 氣相色譜儀及Agilent HP-5 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.5 μm）（美國(guó)安捷倫公司）；DZTW 調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；電子天平（十萬分之一）（杭州友恒稱重設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品麝香草酚（批號(hào)：C100179-191125，純度≥98.00%）、香荊芥酚（批號(hào)：C102093-201028，純度≥99.00%）、α-蒎烯（批號(hào)：GZDD0228-201217，純度≥99.00%）、β-蒎烯（批號(hào)：C101512-201109，純度≥99.00%）（貴州迪大科技有限責(zé)任公司）；乙酸乙酯（天津富宇精細(xì)化工有限公司，分析純）。各藥材均購自其道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)，其來源見表1，均經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為正品。

表1 樣品信息Tab 1 Sample information

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

HP-5 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.5 μm）；FID 檢測(cè)器；檢測(cè)器溫度240℃；進(jìn)樣口溫度240℃；程序升溫，以40℃為起始溫度，保持2 min，以5℃·min－1升至70℃，以0.5℃·min－1升至74℃，以5℃·min－1升至110℃，以10℃·min－1升至230℃，并保持9.8 min；載氣為氮?dú)猓ǎ?9.99%）；柱流量為2.0 mL·min－1；分流比為20∶1；進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取各對(duì)照品適量于5 mL 量瓶中，加乙酸乙酯定容至刻度，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

在Excel 表格中用RAND 函數(shù)將各藥材不同批次隨機(jī)排序得到16 個(gè)隨機(jī)組合，編號(hào)見表1。照表1組合，按1 錢＝3.73 g，分別稱量香薷、厚樸、連翹各7.46 g，金銀花及扁豆花各11.19 g，加水浸泡30 min，照2020年版《中國(guó)藥典》四部通則2204 揮發(fā)油測(cè)定法甲法操作，于測(cè)定器上端加水使之充滿刻度部分，并溢流入燒瓶為止，再加乙酸乙酯5 mL，加熱回流2 h，分取乙酸乙酯液，用鋪有無水硫酸鈉的漏斗濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，即得。

2.4 組方中各藥揮發(fā)油制備

分別稱取組方中各味藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法制備各單藥的揮發(fā)油乙酸乙酯溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗(yàn) 取新加香薷飲供試品溶液、空白溶劑（乙酸乙酯），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，理論塔板數(shù)按麝香草酚計(jì)算不少于10 000，各色譜峰分離度良好且拖尾因子在0.95～1.05，表明該方法的專屬性良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下同一批次（S16）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，13 號(hào)色譜峰峰形及分離度良好，峰面積較大且穩(wěn)定，故以13 號(hào)色譜峰為參比峰，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD（n＝6）為0.0017%～0.16%，相對(duì)峰面積的RSD（n＝6）為0.027%～1.2%，說明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下同一批次（S16）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣，以13 號(hào)色譜峰為參比峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD（n＝6）為0.0017%～0.17%，相對(duì)峰面積的RSD（n＝6）為0.025%～2.0%，說明該供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次藥材按“2.3”項(xiàng)下方法，制成供試品溶液6 份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，以13 號(hào)色譜峰為參比峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD（n＝6）為0.031%～0.19%，相對(duì)峰面積的RSD（n＝6）為0.024%～2.7%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.6 GC 指紋圖譜共有模式的建立與分析

將不同批次的供試品依次進(jìn)樣并記錄色譜圖，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012.130723 版）》，寬度為0.1 min，采用中位數(shù)方法，由于溶劑峰太大，影響后續(xù)相似度計(jì)算結(jié)果，且37 min 后無色譜峰，故選取了3～40 min 間色譜圖進(jìn)行色譜峰匹配處理，生成新加香薷飲GC 指紋圖譜共有模式，見圖1，記錄16 批供試品的指紋圖譜并生成色譜疊加圖，見圖2，并對(duì)16 批樣品圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見表2。以參比峰的保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算各色譜峰保留時(shí)間和保留峰面積與同一圖譜中參比峰的保留時(shí)間和保留峰面積的比值，見表3及表4。

表2 16 批新加香薷飲相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Similarity evaluation of 16 batches of Xinjia Xiangru decoction

表3 16 批新加香薷飲GC 指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間Tab 3 Relative retention time of common peaks in the GC fingerprint of 16 batches of Xinjia Xiangru decoction

表4 16 批新加香薷飲GC 指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積Tab 4 Relative peak area of common peaks in the GC fingerprint of 16 batches of Xinjia Xiangru decoction

圖1 新加香薷飲GC 指紋圖譜共有模式Fig 1 Common mode of GC fingerprints of Xinjia Xiangru decoction

圖2 16 批次新加香薷飲GC 指紋圖譜Fig 2 GC fingerprints of 16 batches of Xinjia Xiangru decoction

結(jié)果顯示16 批新加香薷飲GC 指紋圖譜的共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.18%，說明各共有峰重現(xiàn)性好，各批次間成分差異較??；但共有峰相對(duì)峰面積的RSD較大，說明不同批次新加香薷飲各成分含量存在一定差異，產(chǎn)地對(duì)各成分含量存在一定影響。通過對(duì)相似度評(píng)價(jià)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)16 批樣品中S14、S4、S10、S1、S2 相似度均低于0.90，說明不同批次新加香薷飲指紋圖譜中各共有峰的峰面積存在一定差異。

2.7 GC 指紋圖譜中共有峰指認(rèn)及歸屬

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品及“2.3”項(xiàng)下各單藥揮發(fā)油乙酸乙酯溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，得到混合對(duì)照品溶液的GC 色譜圖及新加香薷飲各峰歸屬圖，見圖3及圖4。通過各圖譜對(duì)比研究，對(duì)指紋圖譜中29 個(gè)共有峰進(jìn)行歸屬分析，其中3、4、5、6、12 號(hào)峰來自于連翹，7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19 號(hào)歸屬于香薷，20、21、25、26、27 號(hào)來自于扁豆花，22、23、24、28、29 號(hào)來自于厚樸，共有峰中未發(fā)現(xiàn)來自于金銀花的特有峰成分。通過比對(duì)指認(rèn)出4 個(gè)色譜峰，其中5 號(hào)為α-蒎烯、6 號(hào)為β-蒎烯、13 號(hào)為麝香草酚、14 號(hào)為香荊芥酚。

圖3 混合對(duì)照品色譜圖Fig 3 Chromatogram of mixed reference substance

圖4 新加香薷飲各峰歸屬Fig 4 Assignment of the peaks of Xinjia Xiangru decoction

3 討論

3.1 供試品溶液制備條件的選擇

通過查閱《中國(guó)藥典》2020年版及多篇文獻(xiàn)[8-12]，本研究以色譜圖中總峰面積、峰形、分離度等為參考指標(biāo)，分別對(duì)供試品溶液提取中提取方式、萃取溶劑、提取時(shí)間進(jìn)行了考察與優(yōu)化，提取方式上分別考察了水蒸氣蒸餾法、超聲法、揮發(fā)油提取法，結(jié)果表明揮發(fā)油提取法所提取的供試品總峰面積大，峰數(shù)目多，提取效率高；提取時(shí)間上先后考察了2、4、6、8 h，發(fā)現(xiàn)提取4 h 較提取2 h 效果更好，但與6 h、8 h 相比差異較小，為提高效率及節(jié)約資源，故選擇提取4 h；萃取溶劑考察了乙酸乙酯、乙醚、石油醚（60～90 ℃）、正丁醇等不同溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于其他溶劑，乙酸乙酯能完全溶解新加香薷飲中揮發(fā)性成分，對(duì)樣品無干擾，且沸點(diǎn)高，毒性低，更不容易揮發(fā)，制得供試品溶液更易于保存，故采用乙酸乙酯作為其萃取溶劑。

3.2 指紋圖譜色譜條件的考察

本研究考察了HP-1（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、HP-5（30 m×0.32 mm，0.5 μm）、DB-1（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、DB-1701（30 m×0.25 mm，0.25 μm）等多種色譜柱，最終發(fā)現(xiàn)HP-5（30 m×0.32 mm，0.5 μm）可以滿足出峰要求，各色譜峰分離度較好，拖尾因子介于0.95～1.05，因此選用此規(guī)格毛細(xì)管柱建立新加香薷飲GC 指紋圖譜。

3.3 GC 指紋圖譜建立的意義

本研究建立了新加香薷飲的GC 指紋圖譜，并對(duì)16 批樣品進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示16批樣品成分含量存在一定差異，所建立的GC 指紋圖譜測(cè)定方法可為新加香薷飲中揮發(fā)性成分的整體評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

本研究所指認(rèn)出的麝香草酚、香荊芥酚、α-蒎烯、β-蒎烯均有一定的抗菌及抗病毒[13-14]功效，以上成分可能是新加香薷飲治療流感疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[15]，但配伍后其相互作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。通過對(duì)16 批樣品共有峰分析發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地來源所組成的新加香薷飲揮發(fā)性成分存在一定差異，不同產(chǎn)地對(duì)其含量及療效的影響有待進(jìn)一步探索。