二硫鍵介導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境智能響應(yīng)型抗腫瘤藥物遞送系統(tǒng)的研究進(jìn)展

鈔艷惠，高梅梅，聶安政，孫丙軍，杜書章*，聶會娟*（.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000；.沈陽藥科大學(xué)，沈陽 006）

腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的健康[1]。化療是目前腫瘤治療的主要手段，尤其是對于不能通過手術(shù)治療和已發(fā)生轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的腫瘤，然而，化療藥物一般具有水溶性差、生物利用度低和全身毒性嚴(yán)重等問題[2]。隨著納米技術(shù)在藥物傳遞領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，這些問題有所改善。但目前臨床應(yīng)用的納米制劑還存在著載藥量低、穩(wěn)定性差、載體材料相關(guān)的毒副作用、藥物在貯存過程中的結(jié)晶和滲漏等缺點(diǎn)[3-5]。因此，設(shè)計(jì)和構(gòu)建高效低毒納米藥物傳遞系統(tǒng)仍然是一個亟待解決的難題。前藥是一類藥理活性很小或無藥理活性的藥物衍生物，給藥后可在體內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生活性代謝物，發(fā)揮治療作用。前藥策略通過對藥物分子中羥基、胺基等官能團(tuán)進(jìn)行可斷裂化學(xué)鍵修飾，能夠克服藥物分子存在的理化性質(zhì)的缺陷，改變藥物的溶解度、穩(wěn)定性等關(guān)鍵的生物藥劑學(xué)性質(zhì)，對提高化療藥物的治療效率有重要意義[6]。

相較于正常組織，腫瘤部位代謝和增殖異常，具有非常復(fù)雜且異質(zhì)性高的微環(huán)境，其特征主要包括乏氧、微酸性、高還原性、高活性氧（reactive oxygen species，ROS）、蛋白酶及酯酶等的過表達(dá)[7]。谷胱甘肽（glutathione，GSH）是哺乳動物細(xì)胞中含量最豐富的硫醇，具有還原性，谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）維持著細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡[8]。細(xì)胞內(nèi)過量的ROS 不利于細(xì)胞氧化還原平衡的維持，進(jìn)而導(dǎo)致癌癥等疾病的發(fā)生。腫瘤微環(huán)境中H2O2的濃度比正常組織高近100 倍，高達(dá)100 μmol·L－1[9]。腫瘤部位特殊的微環(huán)境已被廣泛用來設(shè)計(jì)各種刺激響應(yīng)型納米藥物遞送系統(tǒng)，即使用不同類型的敏感鍵構(gòu)建納米前藥或納米載體，也可使化療藥物選擇性在腫瘤組織中富集，并在腫瘤部位響應(yīng)性釋放，這一策略顯著提高了抗腫瘤藥物的遞送效率，達(dá)到增效減毒的治療效果[10]。

二硫鍵具有獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)，在硫醇的存在下可生物降解，且對不同濃度GSH 刺激的響應(yīng)性有明顯差別，二硫鍵還能夠在腫瘤內(nèi)部高ROS 水平的環(huán)境中發(fā)生氧化反應(yīng)增加藥物遞送體系的親水性，有利于基于二硫鍵的載體或前藥發(fā)生水解反應(yīng)，促進(jìn)納米粒解體和藥物釋放。因此，二硫鍵已被廣泛用來設(shè)計(jì)氧化還原敏感的前藥和納米藥物載體，用于抗腫瘤藥物和熒光探針等的遞送[11]。目前二硫鍵在氧化還原刺激響應(yīng)型納米遞藥系統(tǒng)中的應(yīng)用主要包括二硫鍵作為藥物、藥物與載體、載體之間的連接劑以及藥物載體中的交聯(lián)劑[12]，如表1所示。二硫鍵修飾的納米藥物遞送系統(tǒng)在進(jìn)入腫瘤細(xì)胞之前可以穩(wěn)定存在，在腫瘤細(xì)胞中高濃度GSH 或ROS 條件下，基于二硫鍵的納米前藥或納米藥物載體可迅速降解釋放抗腫瘤藥物，有效避免藥物的過早釋放對正常組織細(xì)胞產(chǎn)生的毒副作用。這一策略為改善抗腫瘤藥物的藥動學(xué)性質(zhì)、提高藥效提供了一種新的式范。

表1 二硫鍵在構(gòu)建氧化還原響應(yīng)型藥物遞送系統(tǒng)中的應(yīng)用Tab 1 Disulfide bond in the construction of redox responsive drug delivery system

1 二硫鍵氧化還原響應(yīng)藥物遞送系統(tǒng)設(shè)計(jì)原理

與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在更高濃度的ROS 和GSH[13]。GSH 在腫瘤細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境高表達(dá)，研究報(bào)道腫瘤細(xì)胞中的GSH 水平是血漿中的1000 倍，且至少比正常細(xì)胞高4 倍[13]。這種濃度差異為基于二硫鍵的氧化還原響應(yīng)型納米給藥系統(tǒng)的特異性藥物釋放提供了先決條件。相較于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞還能不斷產(chǎn)生高水平的ROS，例如過氧化氫、羥基自由基和超氧化物[14-15]。包含二硫鍵、硼酸酯、二茂鐵等ROS 響應(yīng)性基團(tuán)的納米藥物遞送系統(tǒng)可以針對ROS 高表達(dá)的特定部位特異性釋放藥物[16]。

具有二硫鍵的納米藥物遞送系統(tǒng)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)刺激響應(yīng)釋藥機(jī)制如圖1所示。二硫鍵在包含巰基官能團(tuán)的還原性物質(zhì)（如GSH）作用下斷裂形成硫醇，實(shí)現(xiàn)遞藥體系藥物釋放[13]。二硫鍵的氧化響應(yīng)能力表現(xiàn)為在體內(nèi)強(qiáng)氧化自由基（如ROS）作用下，被氧化成砜或者亞砜，使遞藥體系親水性增強(qiáng)，促進(jìn)藥物載體解體進(jìn)而釋放藥物[17]。

圖1 基于二硫鍵的聚合物納米載體氧化還原（GSH/ROS）響應(yīng)釋藥機(jī)制Fig 1 Redox（GSH/ROS）responsive mechanism of polymer nanocarriers conjugating via disulfide bond

二硫鍵橋聯(lián)前藥與基于二硫鍵的納米載體具有相似的氧化還原響應(yīng)性，即腫瘤細(xì)胞內(nèi)高濃度的GSH 或ROS 有利于二硫鍵橋聯(lián)前藥的水解進(jìn)而發(fā)揮藥效，其具體釋藥機(jī)制如圖2所示。

圖2 二硫鍵橋聯(lián)前體藥物氧化還原（GSH/ROS）響應(yīng)釋藥機(jī)制Fig 2 Redox（GSH/ROS）responsive mechanism of disulfide-bridged prodrugs

由于生物體內(nèi)氧化還原環(huán)境的差異性以及二硫鍵對腫瘤細(xì)胞內(nèi)外氧化還原電勢響應(yīng)的不同，二硫鍵具有在血液循環(huán)過程中穩(wěn)定存在，在腫瘤細(xì)胞中才發(fā)生反應(yīng)的特點(diǎn)，因此被廣泛用來設(shè)計(jì)氧化還原敏感的藥物遞送系統(tǒng)。

2 二硫鍵前藥

研究表明藥物-藥物偶聯(lián)物中引入二硫鍵可以誘導(dǎo)疏水性藥物分子自組裝成納米結(jié)構(gòu)聚集體，這主要是由于二硫鍵具有獨(dú)特的二面角，平衡了藥物分子間的非共價(jià)作用力，抑制其在水中結(jié)晶[18-20]。由此制備的前藥自組裝納米粒具有明確的組成結(jié)構(gòu)和極高的載藥量，顯著改善了小分子化療藥物溶解度差、具有非選擇性毒副作用等問題。同時(shí)在前藥結(jié)構(gòu)中引入二硫鍵能夠賦予藥物分子環(huán)境響應(yīng)性藥物釋放的能力。Ma 等[21]將紫杉醇和阿霉素通過二硫鍵共軛相連，制備了具有氧化還原響應(yīng)性的前藥自組裝納米粒，其具有較好的粒徑（180 nm 左右），且穩(wěn)定性良好，由于二硫鍵兩端均是藥物，該前藥納米粒具有89%的超高載藥量。

此外，二硫鍵橋聯(lián)的前藥自組裝納米粒制備相對簡單，結(jié)構(gòu)相對靈活，通過各種多功能化修飾可以實(shí)現(xiàn)藥物的高效遞送。將特異性靶向腫瘤細(xì)胞的基團(tuán)，例如葉酸、抗體、肽類等，通過二硫鍵與小分子化療藥物連接，可實(shí)現(xiàn)主動靶向功能，提高藥物遞送效率和治療效果[22]。例如，由于有些腫瘤細(xì)胞表面會表達(dá)過量的葉酸受體，葉酸可以作為抗腫瘤藥物靶向輸送中的靶向配體。當(dāng)帶有熒光的阿霉素和葉酸靶頭用二硫鍵共價(jià)鍵連接后，阿霉素的熒光會被淬滅[23]。一旦前藥進(jìn)入葉酸受體高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，二硫鍵會與細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的GSH發(fā)生反應(yīng)，使得阿霉素從前藥中釋放出來，藥物熒光得以恢復(fù)，并對腫瘤細(xì)胞有較好的殺傷作用。二硫鍵也被用于連接單克隆抗體與化療藥物，這類可激活前藥利用抗體與腫瘤細(xì)胞表面抗原的特異性結(jié)合反應(yīng)，介導(dǎo)納米粒內(nèi)化到腫瘤細(xì)胞中。例如，2017年上市的抗體藥物偶聯(lián)物奧英妥珠單抗使用含二硫鍵的連接臂共價(jià)連接靶向腫瘤細(xì)胞表面特異性表達(dá)的CD22 抗體的單抗和可誘導(dǎo)DNA 雙鏈斷裂的N-乙?；?γ-卡奇霉素，用以治療急性淋巴細(xì)胞白血病[24]。二硫鍵能夠在血液循環(huán)中穩(wěn)定存在，在腫瘤部位特異性裂解的性質(zhì)極大降低了N-乙?；?γ-卡奇霉素的系統(tǒng)毒性。二硫鍵還可用于化療藥物和熒光成像探針的連接（見圖3），前藥在腫瘤部位特異性激活后同時(shí)具備診斷和治療功能，包括喜樹堿和光敏劑、羥基喜樹堿和熒光物質(zhì)、米托蒽醌和熒光分子共軛等[25-27]。

圖3 基于二硫鍵響應(yīng)的共軛化合物[28]Fig 3 Conjugated compounds based on disulfide bond responses[28]

3 基于二硫鍵的納米載體

3.1 基于二硫鍵的聚合物納米膠束

利用二硫鍵將藥物與聚合物的功能基團(tuán)相連形成的兩親性聚合物-藥物結(jié)合物，可在水中自組裝形成納米膠束，由于膠束穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)，二硫鍵修飾的聚合物納米膠束可穩(wěn)定存在于血液循環(huán)中，通過實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR）靶向腫瘤部位，并具有腫瘤微環(huán)境敏感性釋藥的特點(diǎn)，可以顯著減少藥物對正常組織的損傷，提高治療效果[16，18-20，29]。為了降低聯(lián)合用藥引起的毒副作用、實(shí)現(xiàn)藥物的可控釋放，Yang 等[30]構(gòu)建了具有氧化還原敏感性的共載紫杉醇（paclitaxel，PTX）和阿霉素（doxorubicin，DOX）的膠束體系。使用親水性聚乙二醇單甲醚（methoxypolyethylene glycols，mPEG）通過二硫鍵修飾疏水性的PTX 和DOX，合成的兩種聚合物-藥物結(jié)合物，分別記為mPEG-SS-PTX 和mPEGSS-DOX，具有氧還原敏感性。mPEG-SS-PTX 和mPEG-SS-DOX 均為兩親性嵌段，可以在水中自組裝形成混合膠束，平均粒徑為93.3 nm，膠束能夠通過EPR 被動靶向到腫瘤部位發(fā)揮作用。此外，該藥物遞送系統(tǒng)可以根據(jù)臨床用藥效果精確確定PTX 和DOX 的比例，同時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的氧化還原敏感性釋放[30]。Yang 等[31]合成了兩親性結(jié)合物阿霉素-二氯乙酸鹽，該偶聯(lián)物可以通過使用少量DSPE-PEG2000自組裝成納米顆粒，減少了相關(guān)賦形劑的使用，載藥量高達(dá)71.8%（w/w）。納米粒給藥后沒有對小鼠造成系統(tǒng)毒性，最大耐受劑量為75 mg·kg－1，比游離DOX 高15倍。這些研究為簡化藥物制備過程，增加載藥量，降低全身毒性以及提高抗腫瘤效率提供了有希望的策略。Hu 等[32]制備的新型氧化還原敏感性羥乙基淀粉-阿霉素結(jié)合物（HES-SS-DOX），HESSS-DOX 在細(xì)胞外GSH 水平下相對穩(wěn)定，但在細(xì)胞內(nèi)GSH 水平下迅速釋放DOX。與游離DOX相比，HES-SS-DOX 延長了DOX 的血漿半衰期，增強(qiáng)了DOX 在腫瘤內(nèi)的蓄積。

除了作為聚合物-藥物結(jié)合物之間的連接物，二硫鍵還可作為兩親性高分子材料、聚合物的主鏈間或主鏈與側(cè)鏈之間的連接鍵[12]。通過二硫鍵連接親水和疏水性聚合物鏈段所形成的兩親性共聚物，臨界聚集濃度較低，能夠自組裝形成粒徑適當(dāng)、穩(wěn)定性良好的納米膠束，極大豐富了抗腫瘤藥物遞送載體的結(jié)構(gòu)和功能[33]。文獻(xiàn)報(bào)道了一種氨基葡萄糖（amino-glucose，AG）修飾的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和聚乳酸（polylactic acid，PLA）嵌段聚合物（AG-PEGSS-PLA）[34]，可以在水溶液中自組裝成納米膠束。研究表明包封PTX 的AG-PEG-SS-PLA 納米膠束能夠主動靶向腫瘤細(xì)胞遞送藥物，通過內(nèi)吞途徑被腫瘤細(xì)胞攝取，并且可以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高濃度GSH 的刺激下快速釋放PTX，有效改善腫瘤細(xì)胞的多重耐藥性。Thambi 等[35]利用二硫鍵將石膽酸（lithocholic acid，LCA）連接到羧甲基葡聚糖（carboxymethyl-dextran，CMD）鏈上，所構(gòu)建的偶聯(lián)物（CMD-SS-LCAs）具有自組裝能力。采用乳化法制備的負(fù)載DOX 的納米膠束，載藥量高達(dá)70%，在體外10 mmol·L－1GSH 條件下可實(shí)現(xiàn)DOX 的完全釋放，與游離DOX 相比表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的抗腫瘤效果。

聚合物載體在血液循環(huán)中可能與蛋白或細(xì)胞成分發(fā)生相互作用，使得載體的穩(wěn)定性降低，藥物提前泄漏[36]。使用氧化還原響應(yīng)性裂解的二硫鍵作為聚合物藥物載體中的交聯(lián)劑[12]，可以提高聚合物載體的血液穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的特異性藥物釋放。Guo 等[37]合成了PEG-賴氨酸（lysine，Lys）-苯丙氨酸-（phenylalanine，PPhe）三嵌段聚合物（PEG-Lys-PPhe），使用含二硫醚的交聯(lián)劑3，3'-二硫代雙（磺酸琥珀酰亞氨基丙酸酯）與PLys 側(cè)鏈上的氨基反應(yīng)形成交聯(lián)殼層，膠束表面使用脫氫抗壞血酸（dehydroascorbic acid，DHAA）共價(jià)修飾，由此制備的DHAA 修飾的二硫鍵交聯(lián)聚合物載體可裝載DOX，形成粒徑60.34 nm 左右的納米膠束[DPL（s-s）P/DOX]。DPL（s-s）P/DOX 在生理?xiàng)l件下可以穩(wěn)定存在，能夠通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT1 主動靶向肝癌細(xì)胞，內(nèi)化進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，在胞內(nèi)高濃度GSH 條件下二硫鍵斷裂、膠束發(fā)生降解，使DOX 從膠束中快速釋放出來，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明DPL（s-s）P/DOX 膠束抗腫瘤效率有所增強(qiáng)。

3.2 基于二硫鍵的納米凝膠

近年來含二硫鍵的鏈段作為水凝膠和微凝膠的交聯(lián)劑已經(jīng)成為聚合物載藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在D/L-二硫蘇糖醇、谷胱甘肽和L-半胱氨酸等還原性物質(zhì)存在的條件下，二硫鍵交聯(lián)納米凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞進(jìn)而解體[13]。二硫鍵使得載藥納米凝膠具有優(yōu)異的還原響應(yīng)性，所裝載的藥物可以在氧化還原微環(huán)境中快速釋放。紫草素（shikonin，SHK）是一種通過誘導(dǎo)細(xì)胞壞死發(fā)揮抗腫瘤作用的天然產(chǎn)物，對骨肉瘤有較好的治療作用，但其具有化療藥物普遍存在的溶解性差和非選擇性殺傷正常組織細(xì)胞等缺陷。Li 等[38]使用靶向骨肉瘤的多肽修飾的二硫化物交聯(lián)納米凝膠遞送SHK（STP-NG/SHK），用于降低藥物的全身毒性，提高患者的耐受性。STP-NG/SHK 能夠主動靶向腫瘤細(xì)胞，體外釋放實(shí)驗(yàn)表明二硫鍵在還原條件（高濃度GSH 條件）下20 h 內(nèi)超過75%的SHK 從載體中釋放，而無GSH 存在下僅有少量釋放。Pan 等[39]以N，N'-雙（丙烯酰）胱胺為交聯(lián)劑制備了聚甲基丙烯酸納米凝膠（polymethyl methacrylate-nanogel，PMAA-NG），用以高效遞送DOX。負(fù)載DOX 的PMAA-NG 具有pH/氧化還原雙響應(yīng)釋藥能力，在生理pH 條件下僅有少量藥物釋放，而在酸性和還原環(huán)境（pH 5.0，10 mol·L－1GSH）中，5 h 內(nèi)約91%的DOX 能夠從納米凝膠中釋放出來。PMAA-NG裝載DOX 的載藥量高，研究表明其能通過吞噬作用迅速被腫瘤細(xì)胞攝取，PMAA-NG 在弱酸性和還原性腫瘤微環(huán)境中特異性降解釋藥，具有良好的抗腫瘤作用。

3.3 基于二硫鍵的二氧化硅納米粒

二氧化硅納米粒相較有機(jī)納米載體穩(wěn)定性好、載藥量高，根據(jù)微觀結(jié)構(gòu)的不同可分為介孔硅納米粒（mesoporous silica nanoparticles，MSNs）和無孔硅納米粒（nonporous silica nanoparticles，NSNs）[40]。近年來，許多研究使用二硫鍵對二氧化硅納米粒進(jìn)行修飾，多種具有可控降解特性的納米遞藥系統(tǒng)已經(jīng)被開發(fā)出來[41-42]。該系統(tǒng)可在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高濃度GSH 的誘導(dǎo)下降解進(jìn)而發(fā)揮藥效，對正常細(xì)胞毒副作用小，已被廣泛應(yīng)用于診療制劑的遞送。

其中，MSNs 具有多孔結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，能夠有效裝載藥物并緩慢可控地釋放藥物，是以在醫(yī)藥領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[11，43]。為了避免抗腫瘤藥物在到達(dá)腫瘤部位前從介孔硅納米載體中泄漏，研究中使用含有二硫鍵的中間體將Fe3O4等無機(jī)納米粒、環(huán)糊精等大環(huán)化合物、聚（N-丙烯酰氧基丁二酰亞胺）、聚乙烯亞胺等高分子聚合物與介孔硅表面共價(jià)相連[11，44-45]。這種修飾使得介孔硅孔道在體循環(huán)中處于閉合狀態(tài)，藥物分子無法釋放；當(dāng)納米粒進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，二硫鍵被GSH 等物質(zhì)還原斷裂，介孔硅表面的修飾物解離，封裝的藥物得以釋放[46]，從而提高制劑在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)其在腫瘤部位特異性釋藥。然而純二氧化硅骨架在生物體內(nèi)難以降解，長期使用會在體內(nèi)滯留，繼而引發(fā)嚴(yán)重且無法預(yù)測的毒性風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要設(shè)計(jì)和合成更加安全的二氧化硅載體。通過在二氧化硅骨架中引入二硫鍵構(gòu)建可生物降解的二氧化硅納米粒，不僅保持了二氧化硅納米載體原有的生理穩(wěn)定性，還可實(shí)現(xiàn)腫瘤部位氧化還原微環(huán)境響應(yīng)性生物降解，有助于提高載體的生物安全性和藥物治療效率[47]。例如，Huang 等[48]將雙（3-三乙氧基硅丙基）二硫化物共價(jià)摻雜于MSNs 的二氧化硅骨架中，制備了有機(jī)-無機(jī)雜化的中空介孔有機(jī)硅納米膠體（HMONs@PEG）。二硫鍵的引入加速了HMONs@PEG 骨架在還原微環(huán)境中的生物降解和負(fù)載藥物阿霉素的還原響應(yīng)釋放，增加二氧化硅納米粒生物相容性的同時(shí)，顯著提高了阿霉素的治療效果，并且在一定程度上減少了游離阿霉素的毒副作用。

4 總結(jié)與展望

納米遞藥系統(tǒng)具有可提高疏水性藥物溶解性、延長藥物作用時(shí)間、被動靶向給藥等諸多優(yōu)勢，從而成為近幾十年納米領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。然而，藥物在未達(dá)到腫瘤部位時(shí)已經(jīng)從納米粒中提前泄漏于血液循環(huán)中，導(dǎo)致到達(dá)腫瘤部位的藥物減少，從而使得納米給藥系統(tǒng)臨床療效并無明顯增強(qiáng)。藥物作用于非靶部位容易對正常組織造成損傷從而引起不良反應(yīng)，僅足量作用于靶部位才能引起較好的治療作用。因此不論基于前藥自組裝還是載體的納米遞藥系統(tǒng)，藥物在腫瘤部位的選擇性釋放對于制劑的有效性和安全性都至關(guān)重要。目前，人們開發(fā)了一系列基于二硫鍵的納米前藥及聚合物納米膠束、納米凝膠、二氧化硅納米粒等載藥體系，利用二硫鍵的氧化還原特性實(shí)現(xiàn)腫瘤部位特異性釋放，有效避免了抗腫瘤藥物在血液循環(huán)及進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的過程中從納米粒中滲漏，智能觸發(fā)藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的選擇性釋放，為開發(fā)安全有效的納米制劑提供了巨大的潛力。