Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化制遠(yuǎn)志與蜜遠(yuǎn)志的炮制工藝

袁蒙蒙，陰美華，唐志書(shū)，許洪波*，陳世忠（.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 72046；2.北京大學(xué)藥學(xué)院，北京 009）

遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifoliaWilld.或卵葉遠(yuǎn)志Palygala sibiricaL.的干燥根。氣微，味苦，微辛，具有安神益智、祛痰、消腫解毒的功效，臨床用于治療心腎不交引起的失眠多夢(mèng)、咳痰不爽、瘡瘍腫毒等。遠(yuǎn)志中含有多種皂苷、酮及糖酯類成分，如細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷A，遠(yuǎn)志酮Ⅲ和3，6'-二芥子?；崽堑萚1]。其中皂苷類成分可刺激胃黏膜，反射性地增加支氣管的分泌而發(fā)揮祛痰作用，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致輕度惡心[2-3]。

遠(yuǎn)志最早記載于漢代的《神農(nóng)本草經(jīng)》，在中醫(yī)藥治療中應(yīng)用較為廣泛，其臨床主要使用生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志、蜜遠(yuǎn)志等，不同炮制方法對(duì)于中藥遠(yuǎn)志的有效成分含量和療效存在差異[4]。在《雷公炮炙論》中記載遠(yuǎn)志可用甘草炮制，“凡使遠(yuǎn)志，先須去心，若不去心，服之令人悶。去心了，用熟甘草湯浸一宿，漉出，曝干用之”。有研究表明遠(yuǎn)志經(jīng)蜜炙后，其所含有的細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷減少，提示遠(yuǎn)志炮制解毒的機(jī)制可能是通過(guò)降低皂苷含量來(lái)實(shí)現(xiàn)的[5]。本研究利用單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化制遠(yuǎn)志和蜜遠(yuǎn)志的炮制工藝，同時(shí)建立了HPLC 法測(cè)定不同炮制法遠(yuǎn)志中7 種有效成分的含量，為遠(yuǎn)志的臨床應(yīng)用和工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津UPLC 液相色譜儀（LC-20ADXR 高壓泵、CTO-20AC 柱溫箱、SPD-M20A 二極管陣列檢測(cè)器、SIL-20AC 自動(dòng)進(jìn)樣器、CBM-20A 控制器、DGU-20A5R自動(dòng)脫氣機(jī)、LC Solution 工作站）；電子天平（ME204，瑞士Mettler-Toledo 公司）；101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；多功能粉碎機(jī)（TQ-500，上海天祺盛世科技有限公司）；水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 試藥

生遠(yuǎn)志（寶雞市博仁藥業(yè)有限公司），由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部陳世忠教授鑒定為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifoliaWilld.的干燥根。7 種對(duì)照品信息見(jiàn)表1。乙腈（色譜純，Merck 公司），甲酸（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），超純水（Milli-Q 制備），甲醇（色譜純，Merck 公司）。

表1 對(duì)照品信息Tab 1 Reference material information

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法

2.1.1 HPLC 色譜條件[6-9]色譜柱：Hypersil GOLDTM C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；按照表2 進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為310 nm；進(jìn)樣量為3 μL；柱溫30℃；流速為0.4 mL·min－1。按照上述色譜條件測(cè)定飲片中7 種對(duì)照品的含量，分別測(cè)定對(duì)照品和樣品，記錄色譜圖。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入85%甲醇15 mL，稱定重量，80 ℃條件下加熱回流70 min，放冷，再稱定重量，用85%甲醇補(bǔ)足減失重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，以甲醇倍比稀釋5 次，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，繪制各標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程和線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表3，色譜圖見(jiàn)圖1。

表3 7 種指標(biāo)成分的回歸方程及線性范圍Tab 3 Regression equation and linearity of 7 index components

圖1 遠(yuǎn)志樣品（A）和混合對(duì)照品（B）HPLC 圖Fig 1 High performance liquid chromatography of Polygala tenuifolia（A）and mixed reference substance（B）

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果遠(yuǎn)志酮B、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3，6'-二芥子?；崽恰⒓?xì)葉遠(yuǎn)志皂苷A、遠(yuǎn)志糖苷C、遠(yuǎn)志皂苷B、遠(yuǎn)志皂苷FRSD分別為1.1%、0.26%、0.49%、0.58%、0.90%、0.25%、0.15%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批遠(yuǎn)志藥材粉末，按照“2.1.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，室溫放置，分別在0、2、4、8、12 h，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果遠(yuǎn)志酮B、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3，6'-二芥子酰基蔗糖、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷A、遠(yuǎn)志糖苷C、遠(yuǎn)志皂苷B、遠(yuǎn)志皂苷FRSD分別為2.1%、0.66%、1.0%、2.4%、1.1%、0.66%、1.1%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批遠(yuǎn)志藥材粉末6 份，精密稱定，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果遠(yuǎn)志酮B、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3，6'-二芥子?；崽?、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷A、遠(yuǎn)志糖苷C、遠(yuǎn)志皂苷B、遠(yuǎn)志皂苷FRSD分別為1.3%、0.90%、0.81%、2.7%、2.6%、0.99%、1.2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取9 份已知含量的遠(yuǎn)志飲片粉末（過(guò)三號(hào)篩）0.5 g，每3 份分別按照1∶0.8、1∶1、1∶1.2 精密加入遠(yuǎn)志酮B、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3，6'-二芥子酰基蔗糖、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷A、遠(yuǎn)志糖苷C、遠(yuǎn)志皂苷B、遠(yuǎn)志皂苷F 對(duì)照品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算7種成分的平均加樣回收率和RSD值，遠(yuǎn)志酮B為96.22%（RSD＝1.9%）、遠(yuǎn)志糖苷C 為94.58%（RSD＝2.0%）、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷A 為102.34%（RSD＝1.0%）、遠(yuǎn)志酮Ⅲ為96.63%（RSD＝0.97%）、3，6'-二芥子?；崽菫?8.75%（RSD＝2.3%）、遠(yuǎn)志皂苷B 為98.81%（RSD＝1.3%）、遠(yuǎn)志皂苷F 為103.85%（RSD＝2.6%）。

2.2 評(píng)價(jià)方法

采用加權(quán)平均法，根據(jù)7 種對(duì)照品成分的藥理作用情況，確定遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3，6'-二芥子酰基蔗糖的含量均占權(quán)重的25%，細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷A、遠(yuǎn)志酮B、遠(yuǎn)志糖苷C、遠(yuǎn)志皂苷B、遠(yuǎn)志皂苷F的含量均占權(quán)重的10%[10]。本試驗(yàn)以綜合評(píng)分OD值（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，Y＝（A/Amax）×25%＋（B/Bmax）×25%＋（C/Cmax）×10%＋（D/Dmax）×10%＋（E/Emax）×10%＋（F/Fmax）×10%＋（G/Gmax）×10%，Amax～Gmax分別為各成分對(duì)應(yīng)的最高含量。

2.2.1 制遠(yuǎn)志單因素炮制工藝考察 分別考察輔料甘草汁用量（4%、5%、6%、7%、8%），加水倍數(shù)（25、30、35、40、45 倍）及煎煮時(shí)間（25、30、35、40、45 min）對(duì)遠(yuǎn)志炮制的影響。稱取甘草，純凈水浸泡，煎煮兩次，合并甘草水煎液，加入遠(yuǎn)志采用文火煮至甘草汁吸盡[11-12]。取出冷卻，干燥，即得制遠(yuǎn)志飲片。計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)圖2。炮制輔料用量為5%、加水倍數(shù)35 倍、煎煮時(shí)間為40 min 時(shí)，綜合評(píng)分最高，因此，將其選擇作為響應(yīng)面試驗(yàn)中炮制輔料用量的中心點(diǎn)。

圖2 輔料用量（A）、加水倍數(shù)（B）和煎煮時(shí)間（C）對(duì)制遠(yuǎn)志綜合評(píng)分的影響Fig 2 Influence of the amount of excipients（A），water addition（B）and decoction time（C）on the comprehensive score of Glycyrrhiza Polygala tenuifolia

2.2.2 蜜遠(yuǎn)志單因素炮制工藝考察 考察炮制輔料蜜煉的用量（15%、20%、25%、30%、35%），炮制溫度（100、120、140、160、180℃）、炮制時(shí)間（3、8、13、18、23 min）對(duì)蜜遠(yuǎn)志炮制工藝的影響。稱遠(yuǎn)志樣品200 g，分別燜潤(rùn)2 h，用文火炒至煉蜜被吸盡，遠(yuǎn)志表面為深黃色且不黏手，取出冷卻，干燥，即得蜜遠(yuǎn)志飲片[13-14]。同法計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)圖3。炮制輔料用量為25%、炮制溫度為140℃、烘制時(shí)間為8 min 時(shí)，綜合評(píng)分最高，因此，將其作為響應(yīng)面試驗(yàn)中炮制輔料用量的中心點(diǎn)。

圖3 輔料用量（D）、溫度（E）和炮制時(shí)間（F）對(duì)蜜遠(yuǎn)志綜合評(píng)分的影響Fig 3 Influence of the amount of excipients（D），temperature（E）and processing time（F）on the comprehensive score of Honey-stir-baked Polygala tenuifolia

2.3 制遠(yuǎn)志及蜜遠(yuǎn)志響應(yīng)面法優(yōu)化炮制工藝

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用Design-Expert 8.0.6 軟件，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。選取甘草用量（A）、加水倍數(shù)（B）和煎煮時(shí)間（C）為自變量，以遠(yuǎn)志酮B、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3，6'-二芥子?；崽恰⒓?xì)葉遠(yuǎn)志皂苷A、遠(yuǎn)志糖苷C、遠(yuǎn)志皂苷B、遠(yuǎn)志皂苷F 的綜合評(píng)分（Y1）為響應(yīng)值，考察制遠(yuǎn)志的炮制工藝；同時(shí)，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選用煉蜜用量（D）、炮制時(shí)間（E）、炮制溫度（F）作為考察因素，綜合評(píng)分（Y2）為響應(yīng)值，考察蜜遠(yuǎn)志的炮制工藝。利用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)3 因素3 水平試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表4。試驗(yàn)安排與結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 制遠(yuǎn)志及蜜遠(yuǎn)志響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Tab 4 Factor and level of response surface test of Glycyrrhiza Polygala tenuifolia and Honey-stir-baked Polygala tenuifolia

表5 制遠(yuǎn)志及蜜遠(yuǎn)志響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab 5 Glycyrrhiza Polygala tenuifolia and Honey-stir-baked Polygala tenuifolia response surface test arrangement and results

2.3.2 回歸模型的建立及分析 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合回歸分析，得到Y(jié)1＝80.31＋5.71A＋1.61B＋0.11C＋3.90A2＋1.66B2＋0.21C2－1.10AB＋0.36AC＋0.26BC；Y2＝84.86－3.64A＋0.030B－2.44C－3.47A2－3.16B2－2.19C2＋5.64AB－1.73AC－0.040BC。該模型P＜0.001，具有極顯著性并且與數(shù)據(jù)的擬合度好，誤差低，可以用于進(jìn)一步的分析與檢測(cè)[15-16]，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 制遠(yuǎn)志和蜜遠(yuǎn)志回歸模型方差分析Tab 6 Glycyrrhiza Polygala tenuifolia and Honey-stir-baked Polygala tenuifolia regression model variance analysis

2.3.3 響應(yīng)面圖的分析與優(yōu)化 根據(jù)制遠(yuǎn)志回歸方程可繪制出響應(yīng)曲面，見(jiàn)圖4。由圖4可知，在響應(yīng)面試驗(yàn)中時(shí)間的梯度設(shè)計(jì)較小，對(duì)制遠(yuǎn)志的綜合評(píng)分影響較小。甘草用量與加水量的交互作用對(duì)Y1的影響較大，所以圖中顯示曲面較為陡峭；加水量越大制遠(yuǎn)志提取液中有效成分的含量更高，但從節(jié)約能源和生產(chǎn)耗能方面考慮，加水量應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)調(diào)整。甘草用量為5.96%，加水量為36.21 倍，時(shí)間設(shè)定為40.43 min 時(shí)為制遠(yuǎn)志的最佳炮制工藝。

圖4 不同炮制參數(shù)對(duì)制遠(yuǎn)志綜合評(píng)分Y1 的響應(yīng)面圖Fig 4 Response surface plot of different processing parameters to the comprehensive score Y1 of Glycyrrhiza Polygala tenuifolia

根據(jù)蜜遠(yuǎn)志回歸方程可繪制響應(yīng)曲面，見(jiàn)圖5。由圖5可知，在煉蜜用量與溫度交互作用時(shí)曲面較為陡峭，分析原因可能是由于溫度會(huì)使煉蜜性質(zhì)發(fā)生變化，從而影響蜜遠(yuǎn)志的成分的含量，所以對(duì)蜜遠(yuǎn)志的綜合評(píng)分Y2影響較大。在煉蜜用量為25%，溫度為122.27 ℃，時(shí)間設(shè)定為7.22 min 時(shí)可以得到蜜遠(yuǎn)志的最佳炮制工藝。

圖5 不同炮制參數(shù)對(duì)蜜遠(yuǎn)志綜合評(píng)分Y2 的響應(yīng)面圖Fig 5 Response surface diagram of different processing parameters to the comprehensive score Y2 of Honey-stir-baked Polygala tenuifolia

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

以遠(yuǎn)志為原料，根據(jù)響應(yīng)面預(yù)測(cè)值和實(shí)際操作調(diào)整制遠(yuǎn)志的炮制工藝為甘草用量6%，加水36倍，炮制時(shí)間為40 min；蜜遠(yuǎn)志的炮制工藝為煉蜜用量25%，溫度123℃，炮制時(shí)間為7 min。按上述最優(yōu)制備工藝進(jìn)行驗(yàn)證，平行操作6 次，測(cè)定7 種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表7。所得制遠(yuǎn)志綜合評(píng)分（90.08%）與預(yù)測(cè)值89.69%相近，蜜遠(yuǎn)志綜合評(píng)分（85.45%）與預(yù)測(cè)值87.58%相近，這說(shuō)明該工藝條件穩(wěn)定可行，模型擬合效果良好[17]。

表7 制遠(yuǎn)志和蜜遠(yuǎn)志的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(%)Tab 7 Verification test of Glycyrrhiza Polygala tenuifolia and Honey-stir-baked Polygala tenuifolia (%)

3 討論

本研究利用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了制遠(yuǎn)志和蜜遠(yuǎn)志的炮制工藝，篩選甘草的用量、加水倍量和煎煮時(shí)間以及煉蜜用量、溫度和炮制時(shí)間對(duì)遠(yuǎn)志炮制工藝過(guò)程具有顯著性影響的因素，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立二次多項(xiàng)式回歸模型，明確了最優(yōu)工藝。

在中藥的炮制過(guò)程中輔料的用量和炮制時(shí)參數(shù)的設(shè)定對(duì)與中藥有效成分含量有較大影響，由試驗(yàn)結(jié)果知，制遠(yuǎn)志含量的綜合評(píng)分較蜜遠(yuǎn)志高，蜜炙后所含遠(yuǎn)志皂苷減少，減毒效果更好。甘草制遠(yuǎn)志時(shí)甘草用量和加水量的變化對(duì)綜合評(píng)分影響較大；煉蜜炮制遠(yuǎn)志時(shí)煉蜜的用量和炮制溫度對(duì)蜜遠(yuǎn)志的質(zhì)量影響較大，在試驗(yàn)和生產(chǎn)中需要對(duì)其參數(shù)進(jìn)行量化考察，依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和響應(yīng)面試驗(yàn)因素之間的交互作用結(jié)果得到最佳工藝參數(shù)，制遠(yuǎn)志的最佳炮制工藝為甘草用量6%，加水36 倍，炮制時(shí)間為40 min；蜜遠(yuǎn)志的最佳炮制工藝為煉蜜用量25%，溫度123℃，炮制時(shí)間為7 min。通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)和驗(yàn)證能夠在一定程度上控制炮制遠(yuǎn)志的質(zhì)量，提高工藝的穩(wěn)定性，為中藥遠(yuǎn)志的炮制工藝優(yōu)化提供參考。