吳娜娜,陳星宇,姚輝華,王忠福
(成都市第一人民醫(yī)院1.腫瘤二科,2.胃腸疝外科,3.介入血管外科,四川成都610041)
原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)惡性程度高,發(fā)病隱匿,大部分患者確診時已處于中晚期,且有肝內外轉移,即便接受腫瘤切除術,患者術后5年生存率僅有24%~50%[1-3]。目前臨床針對PHC 高危人群的篩查主要依賴于超聲檢查及甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP),但超聲檢查很難發(fā)現微小病灶,且PHC 患者中AFP 輕度升高或呈陰性占比高達20%~40%,存在一定的漏診率[4-5]。因此,挖掘新的PHC 預后分子標志物,探討新型防治靶點及侵襲轉移分子機制,對延長患者生命具有指導性意見。PHC 的發(fā)生、發(fā)展屬于一個多步驟、多階段過程,每個階段均有著不同的細胞信號傳導通路異常、癌基因及抑癌基因失衡、細胞周期調節(jié)改變等,而miRNA 可作為抑癌基因或癌基因影響細胞凋亡、增殖、遷移等腫瘤相關通路,進而調控腫瘤諸多生物學行為[6-7]。miR-150 是定位于19q13.33的單鏈miRNA,長度為2 nt,近年來不斷有研究發(fā)現,miR-150 在系統(tǒng)性硬化病、惡性腫瘤、組織纖維化、肺動脈高壓等多種疾病中異常表達[8]。有研究發(fā)現,肝癌患者血清miR-150 水平下調,其水平與患者病理學特征密切相關,但尚不清楚miR-150與肝癌患者預后的關系[9]。
選取2016年1月—2018年1月在成都市第一人民醫(yī)院接受手術治療的PHC 患者80 例作為PHC 組。其中,男性52 例,女性28 例;年齡45~79 歲,平均(63.02±5.11)歲;體重指數(body mass index, BMI)18.5~24.6 kg/m2,平均(21.59±2.24)kg/m2。納入標準:①符合《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015年版)》[10]中PHC診斷標準;②Child-Pugh分級A級、B級;③檢測前未接受放療、化療及射頻消融等治療;④首次接受腫瘤切除術,無手術禁忌證。排除標準:①活動性肝炎;②藥物或酒精性肝損傷;③既往接受肝移植或肝膽手術;④腫瘤保留不完整、邊界模糊;⑤凝血功能異常;⑤伴有自身免疫疾病、其他腫瘤或精神疾病。另選取同期本院健康體檢者80 例作為對照組。其中,男性49例,女性31例;年齡42~80歲,平均(62.94±4.86)歲;BMI 18.95~25.2 kg/m2,平均(22.03±2.15)kg/m2。兩組一般資料比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準,患者及家屬自愿簽署知情同意書。
Trizol Reagent 試劑盒(德國凱杰公司),TapMan MicroRNA RT 試劑盒(美國ABI 公司),miR 特異性TapMan 探針及TapMan Universal PCR Master Mix(美國ABI 公司)。
采集PHC 組術前、術后3 d 及對照組體檢當日的5 ml 空腹靜脈血,置于含有EDTA 抗凝試管中,室溫下靜置1 h,3 000 r/min 離心10 min,取上清液于干凈離心管中,置入-80℃冰箱冷凍保存。使用Trizol Reagent 試劑盒提取血清中總RNA,通過TapMan MicroRNA RT 試劑盒將RNA 逆轉錄成cDNA,具體操作參照說明書。使用miR 特異性TapMan 探針及TapMan Universal PCR Master Mix 進行miR-150 的qRT-PCR 檢測,U6作為內參基因,其正向序列:5'-GGTATGATGCAGTAGCACC-3',反向序列 :5'-AAGTGATCGCAGTACGTAC-3',長度分別為121 bp、119 bp;miR-150 正向序列:5'-GTGTATGCAGCAGT AGCTGGA-3',反向序列:5'-CAGTAGTCAGTACGGA CGAAG-3',長度分別為116 bp、118 bp。總反應體系為20 μl,qRT-PCR 反應條件:50℃預變性2 min,95℃預變性10 min,95℃變性15 s,60℃退火1 min,共循環(huán)40 次。根據2-ΔΔCt法計算miR-150 相對表達量。電話隨訪時間截止至2021年2月,統(tǒng)計PHC 患者術后1年和術后3年生存率。
數據分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數±標準差(±s)表示,比較用t檢驗;計數資料以構成比表示,比較用χ2檢驗;Kaplan-Meier法繪制生存曲線,比較用Log-rank χ2檢驗,影響因素的分析用多因素Cox 風險比例模型。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
對照組、PHC組患者術前血清miR-150相對表達量分別為(0.93±0.15)和(0.42±0.09),經t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(t=26.077,P=0.000),PHC組較對照組低。PHC組術后血清miR-150相對表達量為(0.73±0.12),與術前miR-150相對表達量比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=18.485,P=0.000),術后較術前高。
以miR-150 相對表達量0.42 作為分界值,將PHC組分為高表達組和低表達組,分別有48和32例。兩組患者不同組織分化程度、不同TNM 分期、是否伴有肝硬化及是否伴有轉移比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組患者性別比、不同年齡、不同腫瘤直徑、是否伴有肝硬化復發(fā)、是否伴有乙型肝炎、不同AFP 水平、是否伴有門脈癌栓比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。
表1 兩組患者臨床病理特征比較 例
高表達組與低表達組患者3年累積生存率分別為62.50%和21.88%,經Log-rank χ2檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.946,P=0.000),低表達組較高表達組低。低表達組、高表達組中位生存時間分別為19.4 個月、29.0 個月。見圖1。
圖1 高表達組和低表達組患者的生存曲線
單因素、多因素Cox 回歸模型分析結果顯示,miR-150 低表達、腫瘤直徑≥5 cm、TNM 分期Ⅲ期和Ⅳ期、肝硬化、轉移、AFP ≥25 ng/ml 及伴有門脈癌栓是影響PHC 患者3年生存率的獨立因素(P<0.05)。見表2、3。
表2 影響PHC患者3年生存率的單因素Cox回歸分析參數
表3 影響PHC患者3年生存率的多因素Cox回歸分析參數
續(xù)表3
目前,臨床關于PHC 的具體發(fā)病機制尚未完全闡明,但多認為與乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、吸煙、環(huán)境污染等因素相關[11]?,F代研究表明,腫瘤的發(fā)生、發(fā)展屬于分子調控失控過程,涉及諸多環(huán)節(jié),包括抑癌基因失活、癌基因激活、細胞基質間黏附障礙及細胞信號傳導異常等[12]。但對PHC的病理、生理認知仍存在一定不足,深入分析其發(fā)病機制及防治靶點,尤其是借助測序技術、分子生物學等手段探索評估預后的新型標志物,對改善PHC 預后尤為重要。
miRNA 屬于一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA,由22 個核苷酸構成,長度18~25 nt,其與下游多個靶基因結合后可抑制、降解轉錄后基因水平,調節(jié)靶基因蛋白和mRNA 表達,進而調控細胞細胞分化、凋亡及增殖的諸多生物學特性,同時參與調控腫瘤干細胞、調節(jié)腫瘤微生物及腫瘤的遷移、侵襲等過程[13]。ZHANG 等[14]研究發(fā)現,miR-150 在結直腸癌組織中低表達,且可能通過抑制高遷移率族蛋白A2阻斷細胞增殖,下調Cyclin A表達阻滯細胞周期。JIANG 等[15]研究報道,miR-150 在非小細胞肺癌細胞中顯著上調,其可能通過SIRT2/JMJD2A 信號通路對細胞活力及遷移產生調節(jié)作用。喬恩奇等[16]研究發(fā)現,miR-150在乳腺癌中高表達,干擾miR-150表達可促進細胞凋亡及抑制細胞增殖,其作用機制可能與調控PI3K/Akt 信號、上調Leaved Caspase 等有關。以上研究證實,miR-150 在不同環(huán)境及疾病中可發(fā)揮一定的抑癌或促癌因子作用,但其在PHC 中是否發(fā)揮同樣作用及具體的機制尚未完全闡明。ZHANG 等[17]研究發(fā)現,miR-150 在原發(fā)性肝細胞癌中呈低表達,且可能通過下調靶標c-Myb 參與肝臟干細胞自我更新。YU 等[18]研究報道,肝細胞癌患者血清miR-150水平比健康對照者低,術后miR-150水平升高,腫瘤復發(fā)后降低,診斷慢性乙型肝炎病毒感染相關肝細胞癌的AUC 為0.931,敏感性為82.5%,特異性為83.7%,Kaplan-Meier曲線分析顯示,miR-150水平較低的患者總生存期更短。
本研究結果發(fā)現,miR-150 表達可能與PHC 患者組織分化程度、TNM 分期、是否伴有肝硬化及轉移相關,提示miR-150 水平與PHC 患者發(fā)生、發(fā)展關系密切,miR-150高表達可能對抑制癌轉移、減輕病情有一定作用。其原因可能在于miR-150過表達可能抑制癌細胞血管生成及轉移能力,而下調miR-150表達可加速腫瘤細胞轉移、侵襲,增強腫瘤血管生成能力,故miR-150 在PHC 患者中發(fā)揮抑癌作用。多因素Cox 回歸模型分析發(fā)現,miR-150 低表達、腫瘤直徑≥5 cm、TNM 分期為Ⅲ期和Ⅳ期、肝硬化、轉移、高AFP水平及伴有門脈癌栓是影響PHC患者3年生存率的獨立因素。
綜上所述,miR-150 在PHC 患者中低表達,與患者預后、組織分化程度、TNM 分期等關系密切,有望成為評估PHC 患者預后的新型分子標志物。但因本研究存在觀察時間短、樣本量少、樣本來源單一等局限性,有待延長觀察時間、擴大樣本量及范圍進一步探討。