綠原酸通過(guò)ROS/TXNIP/NLRP3信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑減輕膿毒癥小鼠急性肺損傷*

何 荷， 梁隆斌△， 劉 楊， 羅 斌， 周 瑜

（1成都大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，四川成都610081；2成都市第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，四川成都610017）

膿毒癥是因宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)，從而引發(fā)多器官功能障礙，嚴(yán)重危及患者生命［1］。膿毒癥可誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致急性肺損傷［2］，具有很高的死亡率，目前對(duì)于該癥狀仍沒(méi)有較好的治療策略。綠原酸（chlorogenic acid，CGA）廣泛存在于植物中，具有抗炎、抗菌和清除自由基等作用，Zhang等［3］研究顯示綠原酸可抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而減輕應(yīng)激型雞小腸損傷。Chen等［4］研究顯示，綠原酸可提高機(jī)體抗氧化能力。而NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥復(fù)合體不僅促進(jìn)多種炎癥因子的釋放，還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡這一具有炎癥特性的細(xì)胞死亡方式［5］。Hao等［6］研究報(bào)道，NLRP3炎癥復(fù)合體在膿毒癥的發(fā)展過(guò)程中起重要促進(jìn)作用。但是，綠原酸對(duì)膿毒癥肺損傷及活性氧（reactive oxygen species，ROS）/硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）/NLRP3信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究基于綠原酸的效用和膿毒癥急性肺損傷的誘因，擬構(gòu)建膿毒癥小鼠急性肺損傷模型，用以探究綠原酸對(duì)膿毒癥小鼠急性肺損傷的作用及潛在機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 72只健康清潔級(jí)雄性BALB/c小鼠，6~8周齡，體質(zhì)量（21±3）g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2018-0002，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（粵）2018-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為GD202040573，實(shí)驗(yàn)遵循3R保護(hù)原則，本研究經(jīng)成都大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為FLD201911-03。

1.2 主要藥物、試劑和儀器 地塞米松注射液（國(guó)藥集團(tuán)榮生制藥有限公司）；注射用綠原酸（四川九章生物科技有限公司）；小鼠白細(xì)胞介素1β（interleu?kin-1β，IL-1β）ELISA檢測(cè)試劑盒、小鼠IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis fac?tir-α，TNF-α）ELISA試劑盒及小鼠ROS試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒（西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司）；TU?NEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；兔抗小鼠TXNIP抗體、兔抗小鼠NLRP3抗體、兔抗小鼠胱天蛋白酶1（caspase-1）抗體、兔抗小鼠細(xì)胞焦亡關(guān)鍵蛋白gasdermin D的N末端片段（N-terminal fragment of gasdermin D，GSDMD-N）抗體和羊抗小鼠IgGⅡ抗（艾博抗上海貿(mào)易有限公司）。酶標(biāo)儀（上海勝衛(wèi)電子科技有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（南京世研儀器設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型制備 采用腹腔注射脂多糖（10 mg/kg）的方法制備膿毒癥急性肺損傷小鼠模型［7］，當(dāng)出現(xiàn)小鼠活動(dòng)和進(jìn)食明顯減少，口鼻分泌物增多，寒戰(zhàn)、腹瀉、呼吸窘迫等現(xiàn)象，即視為造模成功。本實(shí)驗(yàn)成功制造模模型小鼠60只，隨機(jī)分為5組（每組12只）：模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、綠原酸低、中、高劑量組。另取12只小鼠腹腔注射等量生理鹽水設(shè)為對(duì)照組。造模成功后，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腹腔注射50μg/kg地塞米松［8］；綠原酸低、中、高劑量組小鼠腹腔分別注射5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg綠原酸［9］；藥物注射體積均為10 mL/kg，對(duì)照組和模型組注射等量（10 mL/kg）的生理鹽水。給藥8 h后采集所需樣本。

2.2 ELISA檢測(cè)肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量 處死小鼠，仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，打開(kāi)胸腔暴露心臟，結(jié)扎右肺門后將右肺切下，置于冰上待用。于小鼠頸部解剖暴露氣管，將靜脈留置針插入左主支氣管，注射器抽取300μL 37℃預(yù)熱的滅菌生理鹽水，通過(guò)留置針注入小鼠左肺，這時(shí)左肺膨起并變白，對(duì)其輕柔按摩后，注射器回吸灌洗液，注入、回吸重復(fù)3次，收集灌洗液。注射器重新抽取滅菌生理鹽水進(jìn)行灌洗，灌洗重復(fù)2次，最終收集肺泡灌洗液450μL。通過(guò)無(wú)菌醫(yī)用紗布過(guò)濾灌洗液后，12 000×g離心10 min，吸取上清并按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行IL-1β、IL-6和TNF-α含量的檢測(cè)。

2.3 肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞數(shù)量 取2.2中肺泡灌洗液離心后的沉淀，加入冰醋酸溶破紅細(xì)胞后用1.8 mL生理鹽水重懸細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)。

2.4 肺組織濕重（wet weight，W）/干重（dry weight，D）比值 分離的右肺取下葉，用濾紙拭干，置于精密電子天平稱量肺組織濕重，記為W；隨后將其放入烘箱中70℃烘烤至重量不變，稱量肺組織干重，記為D，計(jì)算W/D比值。

2.5 肺組織HE染色 取約0.5 cm×0.3 cm×1 cm大小的右肺葉上葉組織，浸于4%多聚甲醛中12 h，撈出固定好的組織經(jīng)PBS沖洗，梯度乙醇進(jìn)行組織脫水，液態(tài)石蠟包埋，行4μm切片，載玻片撈片后烘烤2 h。隨后二甲苯、乙醇處理脫蠟，蘇木素浸染，1%鹽酸乙醇分化，伊紅浸染，再次進(jìn)行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后采用中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

2.6 肺組織TUNEL染色 取肺組織石蠟切片，滴加蛋白酶K溶液37℃孵育20 min，PBS洗滌；滴加TUNEL溶液37℃孵育1 h，PBS洗滌后觀察凋亡細(xì)胞情況；再滴加converter-POD溶液37℃孵育30 min，PBS洗滌后進(jìn)行顯色，鏡下觀察。蘇木素復(fù)染，分化、返藍(lán)處理后梯度乙醇脫水，透明、封片，光鏡下觀察。陽(yáng)性細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）呈現(xiàn)棕黃色，正常細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色。凋亡率（%）=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.7 肺組織中SOD、MDA和ROS水平檢測(cè) 取100 mg右肺組織剪碎，與900μL生理鹽水一起加入勻漿器，得到的組織勻漿在4℃條件下12 000×g離心15 min，收取上清通過(guò)各個(gè)試劑盒檢測(cè)肺組織中SOD、MDA和ROS水平。

2.8 Western blot法檢測(cè)TXNIP、NLRP3、caspase-1和GSDMD-N蛋白的表達(dá) 取組織勻漿上清進(jìn)行蛋白定量，取50μg蛋白與4倍體積的上樣緩沖液混勻，10 min沸水浴后上樣進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束取凝膠與濾紙、PVDF膜疊放并進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)好的PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉溶液封閉，加入Ⅰ抗（TXNIP抗體、NLRP3抗體、caspase-1抗體、GSDMDN抗體；均為1∶1 000稀釋）孵育，洗滌后加入羊抗小鼠IgGⅡ抗（1∶3 000稀釋）孵育，洗滌顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，ImageJ系統(tǒng)分析圖片。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS22.0系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料表現(xiàn)形式為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD），多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量

相較于對(duì)照組，模型組IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著升高（P<0.05）；相較于模型組，綠原酸低、中、高劑量組IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著降低（P<0.05）；綠原酸高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組差異不顯著（P>0.05），見(jiàn)表1。

表1 肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量Table 1.The content of IL-1β，IL-6 and TNF-αin bronchoalveolar lavage fluid（ng/L.Mean±SD.n=12）

2 肺組織病理學(xué)變化及炎癥細(xì)胞數(shù)量

對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)正常；相較于對(duì)照組，模型組肺泡間隔增厚，肺泡內(nèi)及肺泡間質(zhì)水腫，甚至部分肺泡塌陷，并且出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P<0.05）；相較于模型組，綠原酸低、中、高劑量組肺泡間隔增厚及水腫情況有所減輕，BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P<0.05）；綠原酸高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組肺組織病理學(xué)改變差異不明顯，BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

表2 肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞數(shù)量Table 2.Number of inflammatory cells in bronchoalveolar la?vage fluid（×107/L.Mean±SD.n=12）

Figure 1.Pathological changesof lung tissue（HEstaining）.圖1 肺組織病理學(xué)變化

3 肺組織濕重/干重比

相較于對(duì)照組，模型組W/D比值顯著升高（P<0.05）；相較于模型組，綠原酸低、中、高劑量組W/D比值顯著降低（P<0.05）；綠原酸高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）。見(jiàn)表3。

表3 小鼠肺組織濕重/干重比Table 3.The wet weight/dry weight（W/D）ratio of lung tissue in mice（Mean±SD.n=12）

4 肺組織細(xì)胞凋亡

相較于對(duì)照組，模型組肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)增多，凋亡率顯著上升（P<0.05）；相較于模型組，綠原酸低、中、高劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)減少，凋亡率顯著下降（P<0.05）；綠原酸高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組肺組織細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖2、表4。

表4 肺組織細(xì)胞凋亡率比較Table 4.Comparison of apoptosis rate in lung tissue（%.Mean±SD.n=12）

5 肺組織中SOD、MDA和ROS水平

相較于對(duì)照組，模型組SOD水平顯著降低，MDA和ROS水平顯著升高（P<0.05）；相較于模型組，綠原酸低、中、高劑量組SOD水平顯著升高，MDA和ROS水平顯著降低（P<0.05）；綠原酸高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組肺組織中SOD、MDA和ROS水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表5。

表5 肺組織中SOD、MDA和ROS水平Table 5.Levels of SOD，MDA and ROSin lung tissues（Mean±SD.n=12）

6 肺組織TXNIP、NLRP3、caspase-1和GSDMD-N蛋白水平

相較于對(duì)照組，模型組TXNIP、NLRP3、caspase-1和GSDMD-N蛋白水平顯著上升（P<0.05）；相較于模型組，綠原酸低、中、高劑量組TXNIP、NLRP3、cas?pase-1和GSDMD-N蛋白水平顯著下降（P<0.05）；綠原酸高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組肺組織TXNIP、NLRP3、caspase-1和GSDMD-N蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖3、表6。

表6 肺組織TXNIP、NLRP3、caspase-1和GSDMD-N的蛋白水平Table 6.The protein levels of TXNIP，NLRP3，caspase-1 and GSDMD-Nin lung tissue（Mean±SD.n=12）

Figure 2.Apoptosis in lung tissue（TUNEL staining）.圖2 肺組織細(xì)胞凋亡（TUNEL染色）

討 論

膿毒癥可造成機(jī)體多個(gè)器官急性損傷，通常肺臟最先受累，膿毒癥誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞嚴(yán)重受損，并且發(fā)生炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，最終引起肺水腫以及肺功能障礙［10-11］。另外，膿毒癥也可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，使得機(jī)體大量合成ROS，導(dǎo)致氧化/抗氧化穩(wěn)態(tài)失調(diào)，引起細(xì)胞凋亡［12-13］。本研究觀察到模型組小鼠肺組織出現(xiàn)肺泡間隔增厚，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等膿毒癥急性肺損傷病理變化，伴隨IL-1β、IL-6和TNF-α含量、W/D比值、細(xì)胞凋亡率及MDA和ROS水平顯著升高，SOD水平顯著降低，提示了本研究模型建立成功，可用于后續(xù)對(duì)于綠原酸作用的研究。

綠原酸具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤和降糖降脂等生物學(xué)功能，本研究結(jié)果顯示，相較于模型組，低、中、高劑量綠原酸均可減輕肺組織損傷，降低IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、ROS含量和W/D比值，減少肺組織細(xì)胞凋亡，而顯著升高SOD水平。Song等［14］報(bào)道，綠原酸可清除并抑制ROS，提供有效的抗氧化應(yīng)激防御。Kim等［15］在乙醇誘導(dǎo)的肝損傷小鼠中顯示，綠原酸可降低細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激水平，發(fā)揮保護(hù)作用。本研究表明綠原酸在膿毒癥急性肺損傷中也可發(fā)揮抑炎和抗氧化損傷作用。另外，通過(guò)抑制促炎介質(zhì)TNF-α、IL-6水平和氧化應(yīng)激反應(yīng)，可緩解膿毒癥急性肺損傷小鼠肺、肝損傷及肺水腫程度，恢復(fù)其體內(nèi)免疫平衡，提高小鼠的存活率［16］。我們的研究提示，綠原酸對(duì)膿毒癥急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用與提高其抗氧化能力，緩解炎癥反應(yīng)有關(guān)。另外，綠原酸調(diào)解炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與抑制NF-κB通路的激活及炎癥因子、Bax等凋亡蛋白的表達(dá)有關(guān)［17］。我們推測(cè)，綠原酸可有效抑制促炎、促氧化因子等表達(dá)而促進(jìn)抗氧化因子活性，從而調(diào)節(jié)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解膿毒癥急性肺損傷小鼠的病變，但其調(diào)節(jié)機(jī)制仍待探究。

Figure 3.The protein levels of TXNIP，NLRP3，caspase-1 and GSDMD-Nin lung tissues.圖3 肺組織TXNIP、NLRP3、caspase-1和GSDMD-N的蛋白水平

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組肺組織ROS水平以及TXNIP、NLRP3、caspase-1和GSDMD-N蛋白表達(dá)顯著上升，綠原酸干預(yù)后，ROS水平及上述蛋白表達(dá)均顯著下降。膿毒癥發(fā)生時(shí)，可誘導(dǎo)ROS的大量合成，促使TXNIP與硫氧還原蛋白解離，TXNIP再與NLRP3結(jié)合，激活NLRP3，以NLRP3為代表的炎性小體則進(jìn)一步切割活化caspase-1，活化的caspase-1不僅可以促進(jìn)多個(gè)炎癥因子的產(chǎn)生，還可以切割GSDMD的N端結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)細(xì)胞焦亡。已有研究顯示，抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD通路，可抑制細(xì)胞焦亡的發(fā)生［18］。Wang等［19］研究顯示，在膿毒癥急性肺損傷小鼠肺組織中存在NLRP3炎性小體的激活，且細(xì)胞焦亡程度較高，是導(dǎo)致肺組織炎性浸潤(rùn)等損傷的原因。目前，抑制NLRP3炎癥小體的激活是多種藥物治療膿毒癥急性肺損傷的作用靶點(diǎn)。Lee等［20］指出，NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡參與了急性肺損傷等肺部炎癥類疾病的發(fā)生。本研究推測(cè)，綠原酸可能通過(guò)抑制ROS/TXNIP/NLRP3信號(hào)通路的表達(dá)，抑制肺組織細(xì)胞焦亡，進(jìn)而減輕膿毒癥急性肺損傷。

綜上所述，綠原酸可能通過(guò)下調(diào)ROS/TXNIP/NLRP3信號(hào)通路的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低炎癥因子的表達(dá)，抑制細(xì)胞焦亡。但是，綠原酸對(duì)膿毒癥急性肺損傷的作用及機(jī)制較為復(fù)雜，尚需后續(xù)進(jìn)一步探究。