氯胺酮相關(guān)性膀胱炎小鼠膀胱平滑肌病理生理改變及其膽堿、嘌呤和ITGB1信號通路表達的變化*

謝 翔， 梁嘉鈺， 唐又山， 羅 闖， 楊佳麗， 黃 閏， 劉 星， 丁 瑜， 陳 環(huán)

（西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川瀘州646000）

氯胺酮（ketarnine）是我國最常被濫用的毒品之一。臨床研究顯示，在氯胺酮濫用的人群中，20%~30%出現(xiàn)嚴重的下尿路癥狀，臨床表現(xiàn)為尿困難、尿頻（嚴重者每15 min排尿1次）、尿急、尿痛，嚴重者膀胱黏膜出現(xiàn)紅斑及潰瘍并伴有黏膜出血，被稱為氯胺酮相關(guān)性膀胱炎（ketamine cystitis，KC）［1］。自KC在2007年被Shahani等［2］首次報道以來，世界各地出現(xiàn)越來越多的相關(guān)病例報道，其發(fā)病機制也因此受到了研究人員的關(guān)注和重視，并取得了一些重要進展。

基于臨床觀察和對動物模型的研究，研究人員們提出了KC發(fā)生的若干理論，包括：（1）氯胺酮及其代謝產(chǎn)物可對膀胱上皮及間質(zhì)細胞造成直接損害，破壞膀胱黏膜表面上皮通透性屏障，使尿液及其中有毒物質(zhì)滲入，導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)和纖維化［3-4］；（2）氯胺酮及其代謝產(chǎn)物損傷泌尿系統(tǒng)微血管內(nèi)皮細胞，使黏膜下毛細血管滲透性和脆性增加，進而導(dǎo)致黏膜缺血壞死、損傷，毒性物質(zhì)滲透致膀胱組織損傷［5-6］；（3）氯胺酮可引起自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致自身免疫調(diào)節(jié)失衡，造成正常膀胱組織損傷，產(chǎn)生慢性炎癥反應(yīng)［7-8］；（4）氯胺酮及其代謝產(chǎn)物促進膀胱中神經(jīng)纖維增生和炎癥，導(dǎo)致神經(jīng)興奮性增強，增加了對疼痛和壓力的敏感性［9］。在以上理論中，膀胱黏膜和上表皮屏障功能受損是目前廣為認可的理論。

最近多篇文章報道氯胺酮能夠改變平滑肌細胞病理生理特性，包括促進平滑肌的凋亡、抑制平滑肌的增殖、改變平滑肌的收縮等［10-12］。尿動力學(xué)檢查顯示KC患者逼尿肌過度活躍，尿道外括約肌舒張不良，膀胱順應(yīng)性降低［13-14］。我們最近也研究報道了氯胺酮能夠顯著影響膀胱平滑肌的增殖和收縮，通過向健康小鼠膀胱中灌注氯胺酮能夠引起膀胱逼尿肌的過度活躍甚至痙攣，表現(xiàn)出KC癥狀［10］。Huang等［12］研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮不僅影響平滑肌細胞的增殖，同時會促進平滑肌細胞膠原蛋白的表達和沉積。以上研究提示我們KC的發(fā)生與膀胱平滑肌的病理生理改變可能有密切的聯(lián)系。

本研究擬通過KC小鼠模型，采用尿動力學(xué)實驗、排尿行為模式研究、離體肌條張力實驗及病理學(xué)實驗等明確KC小鼠膀胱平滑肌的病理生理改變，通過Western blot及免疫熒光實驗研究KC小鼠膀胱平滑肌所涉及的相關(guān)分子信號通路改變，進而進一步擴展和完善KC的發(fā)生機制，為臨床治療提供參考。

材料和方法

1 動物

本實驗采用10周齡、體重為（20.66±1.81）g的清潔級雌性C57BL/6J小鼠，均購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2019-0010。所有小鼠均飼養(yǎng)在標準動物房和入夏飼養(yǎng)環(huán)境：飼養(yǎng)溫度（23±2）℃，濕度50%±10%，光照/黑暗12 h交替，自由飲水進食。所有實驗均根據(jù)實驗室動物護理指南進行。本研究獲得了西南醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會的批準，批準號為No.20180307002。

2 主要試劑

抗III型膠原 α1鏈（collagen type III alpha 1 chain，COL3A1）抗體（#PA5-27828）、Donkey anti-rab?bit IgG Alexa Fluor 488（A32790）和Donkey anti-rat IgG Alexa Fluor 546（A11081）購自Invitrogen；抗M3受體抗體（#PA5-77485）購自Thermo Fisher Scientif?ic；抗M2受體抗體（#APR-002）和抗P2X1受體抗體（#APR-001）購自Alomone Lab；抗整合素β1（integrin β1，ITGB1）抗 體（#9699）、抗 踝 蛋 白1（talin-1，TLN1）抗體（#4021）、抗黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）抗體（#3285）、抗黏著斑蛋白（vinculin，VCL）抗體（#13901）、抗樁蛋白（paxillin，PXN）抗體（#2542）、抗整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）抗體（#3856）、抗I型膠原α1鏈（collagen type I alpha 1 chain，COL1A1）抗體（#72026）和抗actin抗體（#4967）購自Cell Signaling Technology；抗CD39抗體（MAB4398）和 α，β-亞甲基ATP（α，β-methylene ATP，α，β-meATP；#3209）購自R&D System；氯胺酮（#78036637）購 自Patterson Veterinary；卡 巴 膽 堿（carbachol，CCh；#1092009）購自Sigma。

3 方法

3.1 KC小鼠模型的建立 參考Shen等［15］實驗方法，由于小鼠代謝快，按照此方法長期注射氯胺酮不能導(dǎo)致明顯的小鼠膀胱病理損傷，因此我們在前期研究的基礎(chǔ)上對此方法進行了改進，增加了注射氯胺酮的劑量和頻率。實驗組與對照組分別腹腔注射鹽酸氯胺酮注射液（每12 h注射100 mg/kg）與等體積生理鹽水，誘導(dǎo)20周。所有研究內(nèi)容都是以氯胺酮或生理鹽水處理20周的小鼠為實驗對象進行。

3.2 病理染色 斷頸處死模型和對照小鼠，剪開下腹部取出膀胱，生理鹽水洗凈，多聚甲醛浸泡固定過夜。梯度脫水和透明化處理，石蠟包埋并制作切片，石蠟切片脫蠟，蒸餾水清洗后分別進行HE染色、Masson染色及甲苯胺藍染色。隨后染色切片均在光學(xué)顯微鏡下觀察。

3.3 排尿行為模式的研究 參考Chen等［10］的實驗方法，將單只小鼠輕輕放置在鋪有中性濾紙的飼養(yǎng)籠中，將實驗籠放置在安靜區(qū)域4 h記錄小鼠排尿行為模式，期間向小鼠提供充分的食物，但限制飲水（水滴侵入濾紙會改變尿斑面積）。每只小鼠每天1次，重復(fù)兩次。實驗結(jié)束后，將小鼠放回飼養(yǎng)籠，取出濾紙，使用紫外燈對濾紙上的尿斑進行成像，用軟件ImageJ進行圖像分析，統(tǒng)計出主要尿斑（主要尿斑≥80 mm2）個數(shù)，主要尿斑面積和尿斑總面積，從而對小鼠排尿行為模式進行分析研究。

3.4 尿動力學(xué)的檢測 參考Chen等［10］的實驗方法，使用腹腔注射麻醉小鼠，仰臥固定小鼠后將自制的膀胱測壓管經(jīng)膀胱頂端插入膀胱。絲線結(jié)扎膀胱及測壓管，縫合小鼠腹部。測壓管尾端連接三通管，一側(cè)端與尿動力學(xué)檢測儀的壓力傳感器相連，另一端與微量灌注泵相連。生理鹽水（恒溫，37℃）以0.025 mL/min的速度灌注膀胱。使用數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)和計算機記錄系統(tǒng)檢測小鼠膀胱壓力容積曲線，檢測膀胱最大排尿壓、排尿閾值壓、排尿基礎(chǔ)壓、排尿間隔及膀胱順應(yīng)性的變化情況。

3.5 離體肌條張力實驗 參考Chen等［10］的實驗方法，斷頸處死小鼠，剪開下腹部取出膀胱，即刻放入37℃生理液（NaCl 117 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、KH2PO4 1.2 mmol/L、MgCl21.2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L和D-glucose 11 mmol/L）中，小心剔除黏膜層，沿縱軸將組織切成2 mm×8 mm的肌條，每個膀胱可制作肌條4根。取肌條兩端以絲線結(jié)扎，一端固定于盛有37℃生理液浴槽中，且持續(xù)往恒溫水浴槽底部通入95%O2、5%CO2的混合氣體，另一端與拉力傳感器感應(yīng)頭相連。由二維定位支架調(diào)節(jié)肌條長度，拉力傳感器與四通道多功能生理信號放大器相連，用多媒體生物信號記錄分析系統(tǒng)檢測并記錄信號。將肌條靜息張力平衡至3.00 mN，60 min。檢測膀胱平滑肌在膽堿信號（10μmol/L CCh）、嘌呤信號（10μmol/Lα，β-meATP）及去極化（50 mmol/L KCl）刺激下的收縮力大小。以不同頻率電場刺激（electric field stimulation，EFS；1、2、5、10、20和50 Hz，脈寬0.5 ms，串長3 000 ms，電壓50 V）誘發(fā)肌條收縮，檢測肌條在EFS下的收縮力大小。

3.6 Western blot實驗 處死小鼠后，取出膀胱，除去膀胱黏膜層，然后在液氮中勻漿并重懸。將裂解物在4℃下以12 000×g離心15 min。BCA法測定蛋白濃度。使用4%~20%Tris-glycine預(yù)制膠分離樣品（20μg總蛋白質(zhì)），并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用5%脫脂奶粉封閉1.5 h后，將膜與I抗在4℃冰箱孵育過夜。TBST緩沖液洗滌3次，每次5 min，II抗室溫孵育1 h，洗滌3次后ECL發(fā)光試劑盒暗室內(nèi)曝光，檢測免疫印跡條帶的信號強度。

3.7 免疫熒光染色 處死小鼠后，取出膀胱進行包埋，液氮凍存，放入?80℃冰箱保存，將組織切成4μm薄片，用預(yù)冷丙酮固定20 min，PBS漂洗5 min×3次。將上述薄片放入含0.3%Triton的PBS 30 min，然后用1%BSA封閉10~15 min。然后加入兔抗小鼠P2X1受體抗體和大鼠抗小鼠CD39抗體，或大鼠抗小鼠ITG1B抗體和兔抗小鼠COL1A1抗體，4℃過夜，PBS漂洗5 min×3次。然后加入Donkey anti-rab?bit IgG Alexa Fluor 488和Donkey anti-rat IgG Alexa Fluor 546，37℃孵育1 h，PBS漂洗5 min×3次。然后用抗熒光淬滅劑封片，最后用熒光顯微鏡拍片。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPrism 8.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以箱型圖表示，中心線表示中位數(shù)，方框代表75%的數(shù)據(jù)，上邊緣和下邊緣分別代表數(shù)據(jù)集的最大值和最小值。采用t檢驗或Mann-Whitney檢驗進行統(tǒng)計推斷。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 KC小鼠膀胱平滑肌的病理改變

如圖1A所示，對照組小鼠體重增長正常，氯胺酮實驗組小鼠體重增加緩慢，自第4周開始，二者體重有顯著差異（P<0.05），分別為（22.43±1.85）g和（20.75±1.37）g；之后差異更為顯著（P<0.01），至第20周時，對照組和氯胺酮實驗組小鼠體重分別為（26.26±1.80）g和（22.18±0.88）g。改進之后的KC誘導(dǎo)方法降低了小鼠的存活率，在氯胺酮誘導(dǎo)后的第4周開始出現(xiàn)小鼠死亡，至20周時，氯胺酮實驗組小鼠的存活率為35.17%±9.24%，對照組小鼠存活率為84.62%±7.08%，兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性（P<0.01），見圖1B。在第20周時，對照組和氯胺酮實驗組小鼠膀胱重量和尺寸的差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性，對照組和氯胺酮實驗組小鼠膀胱重量分別為（25.85±0.46）mg和（19.65±0.67）mg，見圖1C、E。由于氯胺酮實驗組小鼠膀胱重量和體重均顯著降低，致其膀胱重量（mg）與體重（g）的比值（0.89±0.03）略接近于對照組（0.99±0.02），但差異仍有統(tǒng)計學(xué)顯著性（P<0.05），見圖1D。為了明確KC小鼠膀胱平滑肌的病理變化，我們對小鼠膀胱組織進行了HE染色、Masson染色和甲苯胺藍染色。如圖1F所示，對照組小鼠膀胱表現(xiàn)為正常的組織學(xué)形態(tài)，膀胱壁完整，膀胱黏膜完整，沒有發(fā)生尿路上皮脫離，肌肉層無間隙，肌肉細胞連接緊密，少量膠原蛋白分布其中，肌肉層沒有發(fā)現(xiàn)炎癥細胞浸潤；而在氯胺酮實驗組中，小鼠膀胱壁出現(xiàn)明顯損傷，上皮細胞脫落，膀胱黏膜屏障變薄，肌肉層間隙增大，細胞間質(zhì)顯著增加，并有明顯的炎癥細胞和肥大細胞浸潤，肌肉層表現(xiàn)出明顯的病理變化。

Figure 1.Establishment of mouse ketamine cystitis model and observation of the pathological changes of the bladder.A：alterations of the body weight of the mice；B：the survival rate of the mice；C：summarized data of the bladder weight at 20 weeks；D：summarized data of the bladder-to-body weight ratio at 20 weeks；E：the bladder size observation；F：representative images of HE staining，Masson staining and toluidine blue staining of the bladder cross-sections.The black triangles indicated the thin and disrupted urothelium.The white triangles indicated the infiltrating inflammatory cells.The black stars indicated enlarged space within muscle bundles.The black arrows indicated mast cells.Data were shown as box and whiskers：the centerline was the median of the data set，the box represented 75%of the data，and the whiskers indicated the minimum and maximum.Data were analyzed by the Student's t test.*P<0.05，**P<0.01 vs control group.圖1 氯胺酮相關(guān)性膀胱炎小鼠模型的建立及其膀胱病理改變的觀察

2 KC小鼠膀胱功能受損

為了評估KC小鼠排尿行為模式的變化，我們對對照組和氯胺酮實驗組小鼠進行了尿斑實驗。如圖2A~E所示，對照組小鼠4 h主要尿斑數(shù)為3.31±0.36，面積為（447.7±28.16）mm2，所有尿斑總面積為（1 607±106.7）mm2；氯胺酮實驗組小鼠4 h主要尿斑數(shù)為4.38±0.36，面積為（364.3±18.64）mm2，所有尿斑總面積為（1 727±120.7）mm2。氯胺酮實驗組小鼠在主要尿斑數(shù)上要顯著多于對照組小鼠，而在主要尿斑面積上要顯著低于對照組小鼠，在尿斑總面積上沒有明顯變化。為了進一步分析KC小鼠的排尿行為模式，我們將所有主要尿斑按照面積區(qū)間進行了聚類并計算了分布頻率。如圖2F所示，對照組和氯胺酮實驗組小鼠的主要尿斑面積均主要分布在200~300 mm2區(qū)間，但氯胺酮實驗組小鼠主要尿斑分布在此區(qū)間的頻率要明顯高于對照組小鼠（33.7%vs22.03%）。而在>600 mm2區(qū)間的主要尿斑頻率，氯胺酮實驗組小鼠要低于對照小鼠（7.61%vs26.28%）。以上實驗說明氯胺酮實驗組小鼠排尿行為模式發(fā)生明顯改變，排尿頻率增加，而單泡尿量顯著減少。為進一步分析KC小鼠膀胱功能，我們對2組小鼠進行了尿動力學(xué)實驗。如圖2G~M所示，氯胺酮實驗組小鼠的排尿間隔［（2.22±0.44）min］、最大排尿壓［（25.80±0.67）cmH2O］及膀胱順應(yīng)性［（10.42±2.70）μL/cmH2O］均顯著低于對照組［排尿間隔（4.99±0.66）min，最大排尿壓（35.13±2.85）cmH2O），膀胱順應(yīng)性（25.94±3.75）μL/cmH2O］。氯胺酮實驗組小鼠的排尿閾壓［（24.68±0.45）cmH2O］也顯著高于對照組［（11.43±0.93）cmH2O］，而基礎(chǔ)壓無顯著變化［（8.17±0.89）cmH2Ovs（5.44±1.23）cmH2O］。以上實驗結(jié)果說明KC小鼠膀胱功能受損，表現(xiàn)出明顯的KC下尿路癥狀。

Figure 2.Ketamine cystitis mice exhibited bladder dysfunction.A and B：representative filters showed UV light-illuminated urine spots from a control mouse and a ketamine cystitis mouse；C，Dand E：summarized data of the numbers of primary voiding spots（PVS：voiding spot area≥80 mm2），area of PVS，and the total area of voiding spots per filter；F：summarized frequen?cy distribution histogram of spot size；Gand H：representative cystometrogram traces from a control mouse and a ketamine cystitis mouse；I to M：summarized data of cystometrogram.Data were shown as box and whiskers：the centerline was the median of the data set，the box represented 75%of the data，and the whiskers indicated the minimum and maximum.Data in Figures Cand D were analyzed by the Mann-Whitney test，while other data were analyzed by the Student's t test.*P<0.05，**P<0.01 vs control group.圖2 氯胺酮相關(guān)性膀胱炎模型小鼠膀胱功能受損

3 KC小鼠膀胱平滑肌收縮受損

以上病理學(xué)檢測及膀胱功能實驗表明KC小鼠膀胱平滑肌具有明顯的病理生理改變，為進一步分析膀胱平滑肌的收縮能力，我們進行了離體肌條張力實驗。如圖3A~C所示，對照組和氯胺酮實驗組小鼠膀胱平滑肌在EFS下收縮，收縮力隨著EFS頻率的增加而增加，但氯胺酮實驗組小鼠膀胱平滑肌在各頻率EFS下的收縮力均要顯著低于對照組。統(tǒng)計對照組和氯胺酮實驗組小鼠在各頻率EFS下的收縮力：1 Hz時為（4.42±1.03）mNvs（2.98±1.11）mN；2 Hz時為（5.31±1.26）mNvs（3.41±1.45）mN；5 Hz時為（9.19±3.02）mNvs（5.36±2.44）mN；10 Hz時為（16.14±6.83）mNvs（9.89±4.99）mN；20 Hz時為（26.22±8.87）mNvs（15.35±7.83）mN；50 Hz時為（31.96±8.00）mNvs（21.68±8.93）mN。我們接著檢測了對照組和氯胺酮實驗組小鼠膀胱平滑肌在膽堿信號、嘌呤信號及去極化刺激下的收縮力。如圖3D~F所示，對照組小鼠在10μmol/L CCh刺激下收縮力為（31.93±1.96）mN，在10μmol/Lα，β-meATP刺激下收縮力為（9.46±1.47）mN，在50 mmol/L KCl刺激下收縮力為（30.72±3.07）mN；氯胺酮實驗組小鼠在10μmol/L CCh刺激下收縮力為（24.64±2.78）mN，在10μmol/Lα，β-meATP刺激下收縮力為（5.17±0.84）mN，在50 mmol/L KCl刺激下收縮力為（18.60±3.13）mN。氯胺酮實驗組小鼠膀胱平滑肌在各信號刺激下的收縮力均顯著小于對照組。以上實驗結(jié)果說明KC小鼠膀胱平滑肌收縮受損。

Figure 3.Ketamine cystitis mice had impaired bladder smooth muscle（BSM）contractility.A and B：representative traces of BSM contraction from a control mouse and a ketamine cystitis mouse in response to electric field stimulation（1，2，5，10，20，and 50 Hz）；C：summarized data of electric field-stimulated contraction；D：summarized data of carbachol-induced con?traction；E：summarized data ofα，β-meATP-induced contraction；F：summarized data of KCl-induced contraction.Data were shown as box and whiskers：the centerline was the median of the data set，the box represented 75%of the data，and the whiskers indicated the minimum and maximum.Data were analyzed by the Student's t test.*P<0.05，**P<0.01 vs con?trol group.圖3 氯胺酮相關(guān)性膀胱炎模型小鼠膀胱平滑肌收縮受損

4 KC小鼠膀胱平滑肌相關(guān)信號通路的變化

由于KC膀胱平滑肌收縮受損，我們檢測了涉及膀胱平滑肌收縮相關(guān)的蛋白表達量，包括膽堿受體M2、M3及嘌呤受體P2X1。如圖4A所示，與對照組相比，氯胺酮實驗組小鼠膀胱平滑肌中M3受體表達無明顯變化，M2和P2X1受體蛋白水平顯著降低（P<0.01）。本課題組Xiang等［16］最近發(fā)現(xiàn)ITGB1信號通路在膀胱平滑肌的損傷修復(fù)中具有重要作用，我們接著檢測了其相關(guān)信號通路蛋白在對照組和氯胺酮實驗組膀胱平滑肌中的表達量。如圖4B所示，與對照組相比，氯胺酮實驗組小鼠膀胱平滑肌中ITGB1、TLN1、FAK、COL1A1和COL3A1蛋白水平均顯著升高（P<0.01），VCL、PXN和ILK表達無明顯變化。通過進一步免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)，ITGB1表達在膀胱固有層和平滑肌上，COL1A1主要表達在固有層，在肌肉細胞間隙中也有分布；與對照組相比，氯胺酮實驗組ITGB1在肌細胞上熒光顯著增強，COL1A1浸潤面積增多表達增強，見圖4C。

討 論

臨床病理研究顯示，KC患者膀胱具有明顯的病理生理變化，黏膜層損傷顯著伴有炎癥細胞浸潤和纖維化。Shen等［15］和本課題組Rajandram等［17］報道了KC小鼠模型及其建立方法。Rajandram等［17］采用氯胺酮劑量為30 mg·kg?1·d?1、腹腔注射持續(xù)12周的方式建立了KC小鼠模型。該模型在排尿行為模式及尿動力學(xué)上表現(xiàn)出明顯的下尿路癥狀，但黏膜屏障功能實驗和病理學(xué)實驗顯示膀胱黏膜屏障功能完整，無明顯的病理變化［17］。Shen等［15］采用氯胺酮劑量為100 mg·kg?1·d?1、腹腔注射持續(xù)20周的方式建立了該模型，該模型也表現(xiàn)出明顯的膀胱功能受損，但黏膜層相對完整。通過上述方法建立的KC小鼠模型和臨床患者的膀胱病理特征上具有一定差異，這可能和小鼠的快速代謝有關(guān)。據(jù)報道，小鼠每克體重的基礎(chǔ)代謝率比人高7倍［18］，加之小鼠比人類具有更豐富的細胞色素P450功能基因，使氯胺酮在小鼠體內(nèi)很快被代謝并清除。而氯胺酮可在人體內(nèi)殘留長達11 d，在給兒童單次靜脈注射氯胺酮后14 d，尿液中依然存在去甲氯胺酮［19］。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，通過提高氯胺酮注射頻率和劑量（每12 h給予100 mg/kg劑量）以抵消小鼠對氯胺酮快速代謝的影響，建立了KC小鼠模型。該模型小鼠體重增長緩慢，沒有小鼠出現(xiàn)體重負增長情況，但有部分小鼠死亡。氯胺酮濫用者也普遍存在體重過輕的現(xiàn)象，過量吸食氯胺酮也具有致死風(fēng)險。更重要的是該方法建立的KC小鼠模型表現(xiàn)出與臨床患者相似的病理生理特征，包括排尿頻率增加、膀胱容量顯著降低、膀胱黏膜損傷明顯、上皮細胞脫落、有明顯的炎癥細胞浸潤等。

Figure 4.Altered bladder smooth muscle（BSM）-related signaling pathways in the ketamine cystitis mice.A：Western blot for deter?mining the protein levels of M2，M3 and P2X1 receptors in mouse bladder tissues；B：Western blot for determining the pro?tein levels of ITGB1，TLN1，F(xiàn)AK，VCL，PXN，ILK，COL1A1 and COL3A1 in mouse bladder tissues；C：immunofluores?cence was used to detect the localization and expression of COL1A1（green fluorescence）and ITGB1（yellow fluorescence）in mouse bladder tissues.The urothelium（UR），lamina propria（LP）and BSM layers were indicated.White dashed lines distinguished among the distinct the bladder wall layers.Data were shown as box and whiskers：the centerline was the me?dian of the data set，the box represented 75%of the data，and the whiskers indicated the minimum and maximum.Data were analyzed by the Student's t test.*P<0.05，**P<0.01 vs control group.圖4 氯胺酮相關(guān)性膀胱炎模型小鼠膀胱平滑肌相關(guān)信號通路的變化

本研究發(fā)現(xiàn)KC小鼠的膀胱平滑肌出現(xiàn)明顯病理改變，包括平滑肌層間隙增加、細胞間質(zhì)增多和膠原蛋白沉積，并伴有炎癥細胞和肥大細胞浸潤。KC小鼠膀胱肌肉層的病理改變，在臨床病例的病理標本上也有體現(xiàn)。肌肉細胞間隙改變會影響肌肉細胞之間的信號傳遞，改變肌肉的收縮能力［20］。膠原蛋白沉積和結(jié)締組織增加會影響膀胱壁的彈性使膀胱順應(yīng)性降低［21］。浸潤的炎癥細胞和肥大細胞會釋放各種趨化因子和炎癥因子，促進炎癥發(fā)展，增加神經(jīng)敏感性［22］。因此，KC膀胱肌肉層的病理變化會對膀胱功能具有重要的影響。通過對KC小鼠排尿行為模式的研究，我們發(fā)現(xiàn)小鼠模型排尿行為模式出現(xiàn)明顯改變：排尿頻率顯著增加，單泡尿量明顯降低。進一步的尿動力學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)模型小鼠膀胱功能受損。模型小鼠排尿間隔、膀胱容量、排尿最大值壓力值及膀胱順應(yīng)性均顯著降低，與之前其他動物模型和臨床患者的尿動力學(xué)特征一致［13-14，17］。

膀胱平滑肌的收縮和舒張能力決定了膀胱功能。通過離體肌條張力實驗，我們發(fā)現(xiàn)模型小鼠膀胱平滑肌在各種信號刺激下的收縮能力顯著降低，提示KC小鼠膀胱平滑肌收縮受損。我們最近報道了氯胺酮和去甲氯胺酮作為Cav1.2的抑制劑，不僅可以抑制膀胱平滑肌的增殖，而且會抑制膀胱平滑肌的收縮［10］。Cav1.2在KC膀胱平滑肌中的活性改變可能是平滑肌收縮受損的一個重要原因。Shen等［15］也報道了KC小鼠模型L型鈣離子電壓門控通道的亞基表達降低，從而影響了膀胱平滑肌的收縮。通過蛙卵實驗，氯胺酮還被證明可以抑制膽堿受體信號傳遞［23］。我們通過Western blot發(fā)現(xiàn)膽堿M3受體在KC小鼠膀胱平滑肌中無顯著變化，但M2受體表達顯著降低。M2受體被證實是膀胱中的主要膽堿受體，其蛋白表達量要顯著高于M3受體［24］。P2X1受體通常會在膀胱病理條件下上調(diào)表達，從而導(dǎo)致嘌呤信號介導(dǎo)的膀胱平滑肌收縮增強［25］。但是，我們發(fā)現(xiàn)P2X1受體在KC小鼠膀胱平滑肌中的表達量是顯著降低的，嘌呤信號介導(dǎo)的膀胱平滑肌收縮力也顯著下降，這和之前Meng等［26］的研究不一致，可能是因為建立KC模型的方法差異而導(dǎo)致的，具體機制還需要深入研究。

有研究報道ITGB1是一種重要的跨膜機械壓力感受蛋白，在膀胱上表皮表達，敲除小鼠膀胱上表皮ITGB1會導(dǎo)致膀胱的過度活躍和尿失禁［27］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ITGB1同時大量表達在膀胱平滑肌細胞膜上，其信號通路在膀胱平滑肌損傷修復(fù)中具有重要作用［16］。先前也有研究報道了ITGB及其下游信號通路在血管發(fā)育過程中對血管壁的構(gòu)建發(fā)揮了至關(guān)重要的作用［28-29］。本研究發(fā)現(xiàn)ITGB1及其下游多個信號蛋白在KC模型小鼠膀胱平滑肌中均顯著上調(diào)表達。另外，膠原蛋白在模型小鼠膀胱平滑肌中的蛋白表達量也顯著升高，它們能與ITGB1受體相互作用，促進膀胱平滑肌的修復(fù)損傷［16］。

隨著對KC的深入研究，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)氯胺酮及其代謝產(chǎn)物可對膀胱上皮及間質(zhì)細胞造成直接損害，破壞膀胱黏膜表面上皮屏障功能［3-4］。氯胺酮及其代謝產(chǎn)物還可以損傷泌尿系統(tǒng)微血管內(nèi)皮細胞，引起局部血運障礙［5-6］。氯胺酮也能引起自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致自身免疫調(diào)節(jié)失衡，造成膀胱組織損傷［7-8］。另外，氯胺酮及其代謝產(chǎn)物能促進膀胱神經(jīng)纖維增生和炎癥，導(dǎo)致神經(jīng)興奮性增強［2，4］。我們之前也報道了氯胺酮及其代謝產(chǎn)物對膀胱平滑肌的損傷和收縮抑制［10］。通過戒斷氯胺酮的吸食停止氯胺酮對膀胱各組織的持續(xù)損傷是KC治療的關(guān)鍵。修復(fù)受損組織，包括損傷的膀胱黏膜等對KC的治療具有重要作用。