支氣管哮喘患兒白三烯B4 受體和2 型免疫相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)及其臨床意義

林鴻勝， 楊 丹， 龍巧波， 趙春妹， 鄧廷茂

（1.?？谑协偵絽^(qū)婦幼保健院兒科，海南 ?？?571101；2.張掖市第二人民醫(yī)院兒科，甘肅 張掖 534000；3.?？谑协偵絽^(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，海南 ?？?571101）

支氣管哮喘是一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其特征是氣道高反應(yīng)性、炎癥引起的氣道阻塞及氣道重塑[1]。免疫細(xì)胞和其他炎性介質(zhì)參與了哮喘的病理生理進(jìn)程[2]。哮喘患者中大部分為兒童及青少年[3]。因此，通過各種臨床和生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)兒童哮喘的發(fā)病及其嚴(yán)重程度是小兒呼吸學(xué)科的重要課題。在特應(yīng)性體質(zhì)人群中，過敏原暴露可促進(jìn)輔助性T細(xì)胞2（T helper cell 2，Th2）細(xì)胞因子的激活，特別是白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5和IL-13等2型免疫相關(guān)因子，這提示2型免疫應(yīng)答有可能是哮喘的發(fā)病機(jī)制之一[4]。另外，有研究結(jié)果顯示，白三烯B4受體（leukotriene B4 receptor，LTB4R）在過敏性疾病，包括哮喘中發(fā)揮了重要作用[5]。為此，本研究擬探討LTB4R及2型免疫相關(guān)標(biāo)志物在支氣管哮喘患兒中的表達(dá)及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年1月—2020年1月?？谑协偵絽^(qū)婦幼保健院就診的支氣管哮喘患兒100例（哮喘組）作為訓(xùn)練集，其中男68例、女32例，年齡6～11歲。根據(jù)《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》[6]將100例患兒分為輕癥組（輕中度哮喘，70例）和重癥組（重度及以上哮喘，30例）。選取同期?？谑协偵絽^(qū)婦幼保健院喘息性支氣管炎[7]患兒32例（喘支組），其中男17例、女15例，年齡6～10歲。另選取2020年2—11月?？谑协偵絽^(qū)婦幼保健院就診的支氣管哮喘患兒78例（男48例、女30例，年齡7～12歲；輕癥組55例、重癥組23例）、喘息性支氣管炎患兒21例（男11例、女10例，年齡7～11歲）作為測(cè)試集。支氣管哮喘患兒納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）由2位兒科呼吸病專科醫(yī)生獨(dú)立進(jìn)行評(píng)估，根據(jù)癥狀、體征及支氣管激發(fā)或舒張?jiān)囼?yàn)確診為支氣管哮喘；（2）年齡6～12歲；（3）既往未接受抗哮喘治療；（4）無其他急、慢性呼吸道疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在急、慢性感染；（2）存在其他自身免疫性或免疫缺陷疾??；（3）使用過激素或其他影響免疫系統(tǒng)功能的藥物。本研究經(jīng)?？谑协偵絽^(qū)婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患兒監(jiān)護(hù)人均簽署書面知情同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 采集所有對(duì)象清晨空腹靜脈血5 mL，其中2 mL分離血清，3 mL用于分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。

1.2.2 LTB4R檢測(cè) 采用密度分離液（深圳達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司）分離PBMC，將佛波酯（終濃度20 μg/L）、離子毒素（終濃度為1 μmol/L）及莫能霉素（終濃度2 μmol/L）與單個(gè)核細(xì)胞懸液混勻制成1 mL懸液，置于培養(yǎng)箱中孵育6 h，收集細(xì)胞。LTB4R檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)MA1-20232）購自美國ThermoFisher Scientific公司，采用MACSQuant流式細(xì)胞儀（德國美天旎生物技術(shù)公司）檢測(cè)，嚴(yán)格按儀器和試劑盒說明書要求進(jìn)行操作。每份樣本重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。

1.2.3 2型免疫相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清IL-4、IL-5及IL-13水平，試劑盒（貨號(hào)分別為KAC1281、BMS278、BMS231-3）購自美國ThermoFisher Scientific公司，檢測(cè)儀器為Multiskan FC 酶標(biāo)儀（美國ThermoFisher Scientific公司）。每份樣本重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0及GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用二分類Logistic回歸分析構(gòu)建回歸模型，采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估各項(xiàng)指標(biāo)鑒別診斷支氣管哮喘的效能。采用STRING 11.0軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)互相作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哮喘組與喘支組LTB4R陽性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比較

哮喘組LTB4R陽性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平均高于喘支組（P＜0.01）。見表1。

表1 哮喘組與喘支組PBMC LTB4R陽性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比較

2.2 LTB4R及IL-4、IL-5、IL-13鑒別診斷支氣管哮喘的效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，LTB4R、IL-4、IL-5、IL-13鑒別診斷支氣管哮喘的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.784、0.787、0.688、0.739。采用二分類Logistic回歸分析構(gòu)建4種標(biāo)志物診斷支氣管哮喘的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=14.61+0.74×LTB4R+0.86×IL-4+0.50×IL-5+0.99×IL-13。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型鑒別診斷支氣管哮喘的AUC為0.926，最佳臨界值為468.18，見表2、圖1。在測(cè)試集中驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，鑒別診斷支氣管哮喘的AUC[95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）為0.856（0.758～0.955），敏感性、特異性及準(zhǔn)確性分別為86.66%、73.14%及59.80%，見圖2。

圖1 LTB4R及IL-4、IL-5、IL-13診斷支氣管哮喘的ROC曲線

圖2 在測(cè)試集中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型診斷支氣管哮喘的ROC曲線

表2 LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13診斷支氣管哮喘的ROC曲線參數(shù)

2.3 不同病情支氣管哮喘患兒LTB4R陽性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比較

重癥組LTB4R陽性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平均高于輕癥組（P＜0.001），見表3。

表3 不同病情支氣管哮喘患兒LTB4R陽性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比較

2.4 LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13鑒別診斷輕癥與重癥支氣管哮喘的效能

R O C 曲線分析結(jié)果顯示，LT B 4 R、IL-4、IL-5及IL-13鑒別診斷支氣管哮喘的AUC分別為0.677、0.700、0.689、0.801。采用二分類Logistic回歸分析構(gòu)建4種標(biāo)志物診斷支氣管哮喘的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=-4.38+1.02×LTB4R+0.90×IL-4+0.12×IL-5+1.03×IL-13。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型鑒別診斷支氣管哮喘的AUC為0.926，最佳臨界值為643.61，見表4、圖3。在測(cè)試集中驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的診斷效能，結(jié)果顯示，AUC（95%CI）為0.842（0.764～0.921），敏感性、特異性、準(zhǔn)確性分別為78.22%、71.63%、49.85%，見圖4。

圖3 LTB4R及IL-4、IL-5、IL-13鑒別診斷輕癥與重癥支氣管哮喘的ROC曲線

圖4 在測(cè)試集中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型鑒別診斷輕癥與重癥支氣管哮喘的ROC曲線

表4 LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13鑒別診斷輕癥與重癥支氣管哮喘的ROC曲線參數(shù)

2.5 LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13主要與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）3、血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）、IL-18、C-C基序趨化因子配體（C-C motif chemokine ligand 22，CCL）22、CCL2、IL-1B、CX趨化因子配體8（CX chemokine ligand 8，CXCL8）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、IL-6、白細(xì)胞介素5受體亞單位α（interleukin 5 receptor subunit alpha，IL-5RA）、IL-3、STAT5A、IL-2、GATA結(jié)合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）、白細(xì)胞介素2受體（interleukin 2 receptor，IL-2R）、STAT6、IL-4R、白細(xì)胞介素13受體α1（interleukin 13 receptor alpha 1，IL-13RA1）、集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）2、白細(xì)胞介素13受體α2（interleukin 13 receptor alpha 2，IL-13RA2）之間存在相互作用。見圖5。

圖5 LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

3 討論

白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）在支氣管哮喘的發(fā)病過程中發(fā)揮著多重作用。（1）LTB4可使受抗原刺激的肥大細(xì)胞產(chǎn)生活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），介導(dǎo)Th2細(xì)胞因子的合成；（2）LTB4可通過NADPH氧化酶（NADPH oxidase 1，Nox1）-ROS-核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的合成；（3）LTB4可介導(dǎo)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）-髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MYD88）-LTB4-ROSNF-κB級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子，合成IL-13[8]。LTB4主要通過與其受體LTB4R的相互作用來介導(dǎo)其生物學(xué)功能[9]。2型免疫反應(yīng)即細(xì)胞毒型變態(tài)反應(yīng)，是支氣管哮喘重要的發(fā)病機(jī)制，影響著哮喘的不同表型。根據(jù)哮喘發(fā)病及疾病進(jìn)展過程中是否浸潤2型免疫相關(guān)細(xì)胞及細(xì)胞因子，可將哮喘分為2型哮喘和非2型哮喘[10]。除IL-5外，參與2型免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子還包括IL-4、IL-13等細(xì)胞因子。目前，關(guān)于聯(lián)合檢測(cè)多個(gè)2型免疫反應(yīng)相關(guān)標(biāo)志物及LTB4R預(yù)測(cè)小兒支氣管哮喘發(fā)病及病情嚴(yán)重程度的研究較少。為此，本研究探討了LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13在支氣管哮喘中的價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，哮喘組PBMC LTB4R陽性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平均高于喘支組（P＜0.01）。盡管支氣管哮喘與喘息性支氣管炎在臨床表現(xiàn)上極其相似，難以鑒別，但從病理生理機(jī)制來看，支氣管哮喘主要涉及肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，是由超敏反應(yīng)所致，主要由2型免疫反應(yīng)介導(dǎo)，因此LTB4R及2型免疫反應(yīng)相關(guān)標(biāo)志物會(huì)升高；而喘息性支氣管炎主要由呼吸道合胞病毒等慢性感染所致，主要涉及中性粒細(xì)胞及支氣管黏膜上皮細(xì)胞，雖然也是由超敏反應(yīng)所致，但主要由非特異性免疫反應(yīng)介導(dǎo)，因此IgE水平通常不升高，亦不涉及2型免疫反應(yīng)[11]。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，采用二分類Logistic回歸分析構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型可有效提高相關(guān)指標(biāo)對(duì)支氣管哮喘的診斷效能（AUC為0.926）。本研究結(jié)果還顯示，重癥支氣管哮喘患兒PBMC LTB4R陽性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平均高于輕癥患兒（P＜0.001），構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型鑒別診斷重癥支氣管哮喘的敏感性、特異性及準(zhǔn)確性分別為90.24%、65.42%及50.16%。

本研究針對(duì)LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，4項(xiàng)指標(biāo)主要與STAT蛋白家族、CCL家族及其他IL家族之間存在相互作用。IL與哮喘的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系已明確，而特應(yīng)性哮喘與高水平的Th2細(xì)胞相關(guān)，這些細(xì)胞的分化主要通過兩面神激酶（janus kinase，JAK） -STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行，通過靶向STAT通路可緩解嚴(yán)重哮喘的發(fā)作[12]。CCL與哮喘患兒呼吸功能相關(guān)[13-14]。CCL2的高表達(dá)可促進(jìn)支氣管哮喘患兒巨噬細(xì)胞極化，從而促進(jìn)疾病進(jìn)展[15]。

本研究尚有一些不足之處：（1）本研究樣本量較小，且為單中心研究；（2）哮喘的診斷主要依賴臨床癥狀及體征，血液學(xué)指標(biāo)僅作為輔助診斷指標(biāo)。后續(xù)將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并進(jìn)行多中心研究，進(jìn)一步提高多指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)模型的實(shí)用性，以提高其臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，LTB4R及2型免疫相關(guān)標(biāo)志物IL-4、IL-5、IL-13對(duì)兒童支氣管哮喘的輔助診斷及病情判斷有一定的價(jià)值。