上海地區(qū)伊立替康藥物代謝相關(guān)基因檢測室間質(zhì)量評價(jià)結(jié)果分析

張芃胤， 權(quán) 靜， 王雪亮， 肖艷群， 鮑 蕓

（上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126）

伊立替康為喜樹堿的半合成衍生物，是一種無活性的前體藥物，主要代謝部位為肝臟，是晚期大腸癌的一線治療用藥，也可用于患者術(shù)后的輔助化療；對肺癌、乳腺癌、胰腺癌等也有一定療效[1]。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1（Urdine Diphosphate glucuronosyltransferase 1 family polypeptide A1，UGT1A1）是伊立替康代謝過程的關(guān)鍵酶，它的表達(dá)及活性與患者的不良反應(yīng)密切相關(guān)。目前，已發(fā)現(xiàn)該基因的113個不同突變體，這些突變體可造成UGT1A1活性升高或降低，甚至無活性或無正常的酶表型。從2005年起，美國要求藥品標(biāo)簽上應(yīng)注明推薦患者在服用伊立替康治療前的UGT1A1*28基因型[2]，這樣有助于判斷不良反應(yīng)發(fā)生率。日本將UGT1A1*6和UGT1A1*28列為推薦檢測項(xiàng)目[3]。臨床醫(yī)生應(yīng)盡可能獲取患者UGT1A1基因型檢測結(jié)果，并根據(jù)相應(yīng)結(jié)果慎重考慮給藥劑量，從而在最大程度減輕毒性的同時，使患者獲得最佳療效。

為了保證UGT1A1基因多態(tài)性檢測結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠，必須要有嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施。上海市臨床檢驗(yàn)中心于2019年在上海地區(qū)開展伊立替康代謝相關(guān)基因室間質(zhì)量評價(jià)（external quality assessment，EQA）活動，以評估實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，分析臨床檢測中存在的問題，進(jìn)一步提高該項(xiàng)目的檢測質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

收集2019年上海市臨床檢驗(yàn)中心伊立替康代謝相關(guān)基因EQA參評實(shí)驗(yàn)室采用日常檢測系統(tǒng)（儀器+試劑+方法）檢測樣本后，在規(guī)定時間內(nèi)（自樣本接收后1周之內(nèi)）上報(bào)至上海市臨床檢驗(yàn)中心數(shù)據(jù)庫的檢測結(jié)果。

1.2 方法

1.2.1UGT1A1*6和UGT1A1*28位點(diǎn)基因檢測EQA質(zhì)評物的制備 （1）向上海市血液中心申請獲得約2 0 份丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶陽性人全血樣本（廢棄用血）。采用QIAamp DNA Mini Kit（德國Qiagen公司）提取基因組DNA，采用NanoDrop One超微量紫外可見光分光光度計(jì)（美國ThermoFisher Scientific公司）進(jìn)行濃度測定。以基因組DNA為模版，以5'-ACAAGTGAGCAGGCAGTACC-3'和5'-GTCCGTCAGCATGACATCAA-3'為引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），檢測儀器為Eppendorf GSX1 PCR儀（美國Eppendorf公司）；PCR試劑為AmpliTaq Gold 360 Master Mix（美國ThermoFisher Scientific公司），AxyPrep PCR清潔試劑盒購自美國Axygen公司。擴(kuò)增得到包含UGT1A1*6和UGT1A1*28位點(diǎn)上、下游約940 bp的DNA片段。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃60 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序；測序反應(yīng)通用試劑盒（UGT1A1*6、UGT1A1*28）購自北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司。（2）將原始基因組DNA用TE緩沖液稀釋定量為50 ng/μL的工作液，準(zhǔn)備5種（包含UGT1A1*6和UGT1A1*28的野生型、突變型不同組合）能力驗(yàn)證物品的工作液，40 μL/支分裝。

1.2.2UGT1A1*6和UGT1A1*28基因檢測EQA質(zhì)評物的評價(jià) 制備10個批號能力驗(yàn)證物品，采用等距隨機(jī)抽樣法分別從分裝好的能力驗(yàn)證物品中隨機(jī)抽取10個，在重復(fù)條件下檢測2次，進(jìn)行均勻性評價(jià)。在2次EQA分發(fā)樣本的同時，選取1個批號能力驗(yàn)證物品進(jìn)行同步穩(wěn)定性檢驗(yàn)，取樣數(shù)量為3支，重復(fù)測定2次。

1.2.3 EQA計(jì)劃的設(shè)計(jì) 伊立替康代謝相關(guān)基因檢測EQA計(jì)劃為1年2次，每次EQA樣本盤含有5支樣本，其中2支為UGT1A1*6野生型和UGT1A1*28突變雜合型，2支為UGT1A1*6突變雜合型和UGT1A1*28野生型，1支為UGT1A1*6野生型和UGT1A1*28野生型。將樣本統(tǒng)一編號后，通過冷鏈運(yùn)送至各參評實(shí)驗(yàn)室。要求參評實(shí)驗(yàn)室采用日常檢測系統(tǒng)（儀器+試劑+方法）進(jìn)行檢測，并在規(guī)定時間內(nèi)（自樣本接收后1周之內(nèi)）將檢測結(jié)果上報(bào)至上海市臨床檢驗(yàn)中心數(shù)據(jù)庫，超過規(guī)定時間，系統(tǒng)將不再接收數(shù)據(jù)。

1.2.4 結(jié)果評價(jià) 依據(jù)回報(bào)結(jié)果計(jì)算各參評實(shí)驗(yàn)室的得分情況，每項(xiàng)檢測結(jié)果與預(yù)期相符得10分，總分≥80分判定為成績合格。計(jì)算各樣本的總體符合率和不同檢測方法的整體符合率，統(tǒng)計(jì)錯誤的檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 EQA樣本驗(yàn)證結(jié)果

采用Sanger測序法進(jìn)行基因型檢測，確定EQA樣本相應(yīng)靶值，結(jié)果見圖1；樣本盤構(gòu)成及預(yù)期結(jié)果見表1。采用熒光分子雜交法進(jìn)行基因型檢測，評價(jià)EQA樣本的均勻性和穩(wěn)定性，檢測結(jié)果與預(yù)期值的符合率均為100%，EQA樣本具有良好的均勻性和同步穩(wěn)定性。

圖1 UGT1A1＊6和UGT1A1＊28野生型和突變雜合型Sanger測序圖

2.2 UGT1A1*6和UGT1A1*28基因檢測實(shí)驗(yàn)室總體回報(bào)情況

參加2019年2次伊立替康代謝相關(guān)基因EQA計(jì)劃的實(shí)驗(yàn)室分為29家和31家，在規(guī)定時間內(nèi)收到的有效回報(bào)結(jié)果分別為25份和22份。在第1次的EQA中，采用了A組（11家）和B組（14家）2套編號不同的樣本。2次EQA中，熒光分子雜交法是實(shí)驗(yàn)室最常用的檢測方法，所占比例分別為52.00%（13/25）和50.00%（11/22）；其次為Sanger測序法，所占比例分別為44.00%（11/25）和45.45%（10/22）；僅有1家實(shí)驗(yàn)室采用了二代測序的方法。見表1、表2。

表1 第1次伊立替康代謝相關(guān)基因檢測EQA樣本盤構(gòu)成及檢測符合率

表2 第2次伊立替康代謝相關(guān)基因檢測EQA樣本盤構(gòu)成及檢測符合率

2.3 各實(shí)驗(yàn)室檢測能力評價(jià)

2019年上海地區(qū)伊立替康代謝相關(guān)基因2次EQA結(jié)果顯示，近90%的臨床實(shí)驗(yàn)室均取得了滿分成績，有2家實(shí)驗(yàn)室不合格。見表3。

表3 2019年上海地區(qū)伊立替康代謝相關(guān)基因EQA成績及總體符合率

2.4 3種不同檢測方法的結(jié)果比較

本研究將2次EQA中3種不同檢測方法的檢測效能進(jìn)行了比較，熒光分子雜交和二代測序法的陰陽性樣本符合率均為100.00%，而Sanger測序法與之相比存在一定差距。見表4。

表4 2019年上海地區(qū)伊立替康代謝相關(guān)基因EQA不同檢測方法符合率 %（份/份）

3 討論

在伊立替康的代謝過程中，血液和腸道中的活性代謝產(chǎn)物SN-38水平過高可導(dǎo)致人體出現(xiàn)2種最突出的劑量限制毒性：粒細(xì)胞減少和遲發(fā)性腹瀉[5-7]。SN-38主要是通過位于肝臟的UGT1A1的催化作用而轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性的SN-38G，再通過尿液、膽汁排出?！端幬锎x酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測技術(shù)指南（試行）概要》[8]指出：與伊立替康代謝相關(guān)的基因型主要為UGT1A1*6和UGT1A1*28。UGT1A1*28基因啟動子存在多態(tài)性，表達(dá)量隨著TA重復(fù)序列的增加而下降，突變純合子個體SN-38葡萄糖醛苷化活性僅為野生型純合子的35%。UGT1A1*6（211G＞A）是亞洲東部人群中特有的突變等位基因[9]，突變頻率約為13%。該等位基因可使UGT1A1的活性下降70%，增加了伊立替康毒性作用的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，可使4級中性粒細(xì)胞減少癥的發(fā)生率升高3倍[10-12]。

上海市臨床檢驗(yàn)中心2019年第1次區(qū)伊立替康代謝相關(guān)基因EQA計(jì)劃采用了2套編號不同的樣本（A組和B組），這一措施在一定程度上能防止串通，可更好地反映各參評實(shí)驗(yàn)室的真實(shí)水平。結(jié)果表明，大部分開展此項(xiàng)目的臨床實(shí)驗(yàn)室成績理想，但也有部分實(shí)驗(yàn)室與預(yù)期結(jié)果有一定的偏差。與預(yù)期結(jié)果不符的實(shí)驗(yàn)室均采用Sanger測序法檢測，且均為實(shí)驗(yàn)室自建方法（laboratory developed test，LDT）。Sanger測序法一直被認(rèn)為是臨床基因分型檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”[13]，操作步驟較多，出現(xiàn)差錯的概率較高，而且測序結(jié)果需要人工判讀，對檢測人員的要求較高，需要加強(qiáng)檢測位點(diǎn)相關(guān)知識的培訓(xùn)，完善相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，并嚴(yán)格執(zhí)行，避免誤報(bào)。如UGT1A1*28的結(jié)果判讀，需要統(tǒng)計(jì)TA重復(fù)的次數(shù)，TA6指A（TA）6TAA，TA7為A（TA）7TAA，很容易將不屬于突變區(qū)域的TAA堿基序列誤判為重復(fù)的TA序列，造成錯誤結(jié)果。此外，樣本處理過程中產(chǎn)生的交叉污染，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中存在高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物污染，純化不夠徹底造成測序雜峰等，都是結(jié)果出現(xiàn)偏差的潛在原因。同時，實(shí)驗(yàn)室使用的LDT是否進(jìn)行過性能驗(yàn)證，準(zhǔn)確度、精密度、可報(bào)告范圍、參考區(qū)間、分析靈敏度和特異性等參數(shù)是否能夠滿足臨床需求，還需要進(jìn)一步的臨床驗(yàn)證[14]，這些都對臨床實(shí)驗(yàn)室提出了更高的要求。隨著國家相關(guān)政策的調(diào)整以及Sanger測序法技術(shù)門檻和成本的降低，使得只能在少數(shù)專業(yè)檢測機(jī)構(gòu)開展的項(xiàng)目逐步普及化，更加凸顯了實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)質(zhì)量控制措施的重要性。

伴隨著個性化用藥在臨床中的廣泛應(yīng)用，通過檢測UGT1A1*6和UGT1A1*28基因型，臨床醫(yī)生在使用伊立替康時劑量能夠更加精確。上海市臨床檢驗(yàn)中心開展的伊立替康代謝相關(guān)基因EQA計(jì)劃，全面評價(jià)了上海及周邊地區(qū)臨床實(shí)驗(yàn)室該項(xiàng)目的檢測質(zhì)量。希望通過EQA計(jì)劃的開展和深入，幫助臨床實(shí)驗(yàn)室及時發(fā)現(xiàn)日常工作中的問題，保證檢測質(zhì)量。