黃河三角洲濱海濕地微生物多樣性及其驅(qū)動因子

李金業(yè),陳慶鋒,2,*,李 青,趙長盛,馮 優(yōu),李 磊

1 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省分析測試中心, 濟南 250014 2 山東師范大學(xué)地理與環(huán)境學(xué)院, 濟南 250014

濱海濕地是陸地和海洋生態(tài)系統(tǒng)之間的過渡帶,具有生物多樣性高、生態(tài)敏感性強等特點[1]。微生物是濕地環(huán)境和有機物分解的重要組成部分,它可以改變濕地土壤的理化特性,在土壤有機質(zhì)動態(tài)、能量傳遞和元素生化循環(huán)等方面起著重要作用[2]。同時,濕地微生物多樣性高對于土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和服務(wù)功能的提高具有不容忽視的作用,將有助于提高微生物種群的遺傳多樣性[3],并對提高物質(zhì)的營養(yǎng)循環(huán)和重要生態(tài)系統(tǒng)過程的效率有積極的影響[4]。近年來,濕地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的重要性越來越受到關(guān)注[5]。

黃河三角洲濱海濕地不僅是我國暖溫帶地區(qū)最年輕、最完整、面積最大的濕地之一[6],也是世界上陸地-海洋相互作用最活躍的區(qū)域之一,在濕地生物多樣性保護(hù)和水質(zhì)凈化中發(fā)揮著重要作用[7]。由于圍墾、海岸侵蝕和石油污染等人為干擾,濱海濕地正經(jīng)歷著持續(xù)而嚴(yán)重的退化,面積不斷減小[8]。微生物對環(huán)境變化非常敏感,這些破壞效應(yīng)會影響濕地土壤微生物的群落組成。反過來,濕地土壤微生物的變化又會導(dǎo)致濕地生態(tài)系統(tǒng)的整體結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化[9]。濕地植物與土壤環(huán)境因子相互作用,對土壤微生物群落及功能多樣性產(chǎn)生影響[10]。濱海濕地土壤養(yǎng)分含量低、透氣性差,植物、土壤微生物多樣性均不高,尤其是原生鹽堿土壤中的微生物群落多樣性更低[11]。目前已有研究揭示了黃河三角洲濕地的植被格局分布,以及不同類型植被恢復(fù)對土壤性質(zhì)和植被多樣性的影響[12-13]。濕地植物可以通過提供凋落物中的營養(yǎng)物質(zhì)直接影響土壤微生物的功能[14],根際分泌物會改變氧化還原電位、pH值等根際環(huán)境,間接決定根際微生物種類和數(shù)量[15],植物根際鐵錳氧化膜與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也存在某種關(guān)聯(lián)。有關(guān)黃河三角洲濱海濕地微生物群落多樣性與植被關(guān)系的研究直到20世紀(jì)90年代才逐步開展[16-17],植物群落和環(huán)境因子對濕地土壤微生物影響的研究越來越得到關(guān)注。

本研究以黃河三角洲濱海濕地表層土壤和植物根際為研究對象,通過高通量測序技術(shù)對土壤和植物根際中的微生物進(jìn)行了初步研究,旨在揭示植被根際微生物與土壤微生物的結(jié)構(gòu)和豐度特征,分析微生物群落與土壤環(huán)境因子之間的內(nèi)在關(guān)系,將為認(rèn)識黃河三角洲濱海濕地的生物地球化學(xué)循環(huán)提供微生物生態(tài)學(xué)視角。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本研究以黃河三角洲濱海濕地為研究對象,研究地點位于黃河三角洲的中心區(qū)域(117°31′—119°18′E,36°55′—38°16′N)。該地區(qū)位于渤海灣南岸和萊州灣西岸,屬于溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候。研究區(qū)內(nèi)主要為鹽漬型土壤,受潮汐海水入侵影響,土壤鹽漬化嚴(yán)重(高達(dá)70%),主要濕地植物為蘆葦、堿蓬和檉柳。

1.2 樣品采集

通過野外實地調(diào)研,2018年5月選取區(qū)域內(nèi)代表性的翅堿蓬群落、蘆葦與檉柳灌木混合植被群落、灘涂裸地、油田等13個采樣點為調(diào)查對象進(jìn)行采樣(圖1)。土壤樣品采樣時,首先去除土壤表層有機物和細(xì)根等雜質(zhì),然后按照5點取樣法用鐵鍬采集20 cm × 20 cm 樣方中表層(約0—25 cm)土樣,每個采樣點重復(fù)3次,共39個樣品。為了研究植物對土壤微生物種群的影響,選擇了4個優(yōu)勢種,即蘆葦、檉柳、堿蓬和蒿,用鐵锨挖出植物,收集根際土壤,共采集9個根際土壤樣品(表1)。所有樣品儲存在采樣袋后,放在液氮中冷卻,然后送到實驗室。每個樣品分成兩部分：一部分樣品風(fēng)干研磨后,分別過不同孔徑的篩子用于土壤理化性質(zhì)測定；另一部分在-80℃的環(huán)境中冷凍保存,送到北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司測序。

表1 土壤采樣點及生態(tài)系統(tǒng)狀況

圖1 黃河三角洲濕地監(jiān)測點

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

1.4 土壤總DNA提取、PCR擴增及測序

選用 Fast DNA SPIN Kit for Soil 試劑盒提取土壤微生物基因總DNA,將提取得到的土壤DNA溶解于70 μL無菌TE緩沖液中,具體提取過程按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。電泳檢測后,對16S rRNA V3+V4(細(xì)菌)區(qū)域進(jìn)行擴增,細(xì)菌引物[18]序列為：338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′及806R 5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′,使用Illumina Hiseq測序平臺,利用雙末端測序(Paired-End)的方法,構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行16S rRNA測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

通過對Reads拼接過濾,OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類(97%),并進(jìn)行物種注釋及豐度分析,揭示樣品的物種組成。通過α多樣性的五個指數(shù),包括Coverage,Simpson,Chao1,ACE和Shannon指數(shù)分析樣本內(nèi)的物種多樣性,進(jìn)一步對β多樣性分析(Beta Diversity)和顯著物種差異進(jìn)行分析,挖掘樣品之間的差異。本研究選擇UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)分析物種組成相似度。

使用Microsoft Excel和Adobe Illustrator 16.0(Adobe Systems Inc., San Jose, USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和繪制圖形。通過Alpha多樣性分析,統(tǒng)計了各樣品的覆蓋度、Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)和shannon指數(shù)。使用QIIME軟件進(jìn)行β多樣性分析來評估樣品在物種復(fù)雜性方面的差異。利用SPSS19.0(International Business Machines Corporation, Armonk, USA)軟件,采用主成分分析(PCA)和相關(guān)分析(CA)分析土壤理化性質(zhì)間的關(guān)系,顯著性差異定義為P<0.05。采用Canoco 5.0(Microcomputer Power, New York, USA)軟件分析土壤理化性質(zhì)與土壤細(xì)菌群落多樣性之間的關(guān)系,識別影響濕地群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤和根際微生物樣品測序結(jié)果

通過雙末端測序(Paired-End)并優(yōu)化后,13個土樣共獲得853672條有效序列(Effective Tags),Effective Tags平均長度集中在411—421 bp之間,占PE Reads序列的86.28%,質(zhì)量值≥30的堿基約占總堿基數(shù)的95.5%—96.08%。序列的長度和數(shù)量是將序列匹配到數(shù)據(jù)庫從而產(chǎn)生基因注釋的關(guān)鍵,保證了微生物物種多樣性分析的科學(xué)性、真實性。13個土樣中的微生物歸屬于27門、54綱、143目、282科、627屬和705種,微生物多樣性指數(shù)和覆蓋率見表2。從表2可以看出,蘆葦檉柳區(qū)(HW4-2)的OTU數(shù)最多,高于其他地區(qū)。微生物豐富度指數(shù)(Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù))表明蘆葦檉柳生長區(qū)的微生物豐度高于灘涂裸地(HW1-1、YWS2和YWS6)、堿蓬區(qū)(HW6-1、YWS3)和棉田區(qū)(HW5-1),海漫灘(YWS2)中微生物豐度明顯高于河漫灘(YWS6)和泥灘(HW1-1)。

香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)是反映樣本微生物多樣性的另一種表現(xiàn)形式,從圖2和表2可以看出土壤樣品中細(xì)菌的香農(nóng)指數(shù)大約在4—5.5之間,而根際細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)范圍約為0—4,說明土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性均明顯大于植物根際細(xì)菌。根際中OTU豐富度的下降歸因于根際過程的均質(zhì)化作用,從而減少了生態(tài)位。

圖2 樣品香農(nóng)指數(shù)曲線

表2 微生物的多樣性指數(shù)及覆蓋率

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析

在所有濕地土壤樣本中,土壤微生物表現(xiàn)出較高的多樣性(圖3)。樣本的門水平分類中豐度前十的物種組成基本一致,主要包括變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteri)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes),其中,細(xì)菌分布以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門為主,這四種細(xì)菌門在各樣本中合計占比高于90%,這可能表明了它們在濕地中的穩(wěn)定性,這與之前變形桿菌門在黃河口數(shù)量最多的研究結(jié)果[19-20]不同。與土壤微生物相比,根際微生物的優(yōu)勢菌群發(fā)生了變化(圖3),以藍(lán)藻門細(xì)菌為主,豐度較高的菌群還有變形菌門、放線菌門和厚壁菌門,和占比約為總菌群的90%,特有的細(xì)菌為Patescibacteria。

圖3 樣品中細(xì)菌群落門水平上的相對豐度

圖4為基于Beta多樣性分析得到的UPGMA聚類樹與屬水平上細(xì)菌豐度的結(jié)合圖。在聚類樹中,樣品越靠近,枝長越短,表示兩個樣品的物種組成越相似。在土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中,YWS3和HW5-1與其他采樣點細(xì)菌結(jié)構(gòu)差異性最大,YWS3中的細(xì)菌豐度排名前10的物種較少,HW5-1以Coffea_arabica_coffee為主。HW1-1與YWS2物種組成相似,但與YWS6物種組成相似性較遠(yuǎn)。油井附近采樣點微生物結(jié)構(gòu)也不同,YWS1細(xì)菌分布均勻,而Uncultured_bacterium_f_muribaculaceae在YWS5中豐度較高。豐度檢測前10的屬包括Lactobacillus(乳酸菌屬)、Uncultured_bacterium_f_muribaculaceae、Rhodococcus(紅球菌屬)、Bifidobacterium(雙歧桿菌屬)、Coffea_arabica(咖啡屬)、Thauera(索氏菌屬)、Ruminococcus(瘤胃球菌屬)、Ochrobactrum(蒼白桿菌屬)、Flavobacterium(黃桿菌屬)、Escherichia_Shigella(埃希氏桿菌屬),主要是屬于厚壁菌門和酸桿菌門。植物根際細(xì)菌中,HW3-15P1與HW2-15P1的種群結(jié)構(gòu)相似,以Lolium_perenne為主,而其他根際細(xì)菌結(jié)構(gòu)以Coffea_arabica_coffee為主。豐度檢測前10的屬主要包括Coffea_arabica_coffee、Lolium_perenne、Pseudoalteromonas(假交替單胞菌屬)、Oryza_meyeriana、Vibrio(弧菌屬)、Streptomyces(鏈霉菌屬)、Photobacterium(發(fā)光桿菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)、Marinomonas(海單胞菌屬),主要是屬于藍(lán)藻門、變形菌門和放線菌門。

圖4 屬水平上UPGMA聚類樹與柱狀圖組合圖

黃河三角洲濕地微生物豐度和結(jié)構(gòu)的差異性主要表現(xiàn)在同一生境類型不同采樣點間微生物物種差異、不同生境類型下微生物物種差異及同一采樣點植物根系與土壤中微生物的差異。HW1-1、YWS2、YWS6為漫灘地,有少數(shù)植被覆蓋,細(xì)菌門水平上的豐度大小順序依次為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、藍(lán)藻門,YWS5為油田附近灘涂,其細(xì)菌豐度依次為擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和藍(lán)藻門。檉柳區(qū)(HW4-1、YWS4)與植被混合區(qū)(HW2-1、HW3-1、HW4-2)菌門豐度相近,依次為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和藍(lán)藻門；翅堿蓬覆蓋區(qū)的優(yōu)勢菌群豐度差異較大,翅堿蓬(YWS3)中變形菌門和擬桿菌門的豐度高于HW6-1,厚壁菌門、放線菌門和藍(lán)藻門的豐度則低于HW6-1；棉田(HW5-1)以藍(lán)藻菌門的產(chǎn)氧光細(xì)菌綱為主,次優(yōu)勢類群為厚壁菌門、變形菌門和放線菌門,這一現(xiàn)象與植物根系的菌群結(jié)構(gòu)極其相似。

2.3 土壤環(huán)境因子與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析

2.3.1土壤環(huán)境影響因子及其相關(guān)性分析

表3 不同土壤的主要環(huán)境參數(shù)

2.3.2土壤環(huán)境因子與微生物群落多樣性的相關(guān)性分析

表4 土壤環(huán)境因素的相關(guān)系數(shù)矩陣

表5 土樣的主成分分析和因子載荷

圖5 門和屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境變量的RDA排序圖

3 討論

3.1 土壤和根際微生物群落結(jié)構(gòu)特征

濕地土壤具有較厚的有機質(zhì)層,其溫度和氧含量比其他類型的土壤更穩(wěn)定,使得濕地細(xì)菌群落具有相對穩(wěn)定的組成以保證其生態(tài)功能,這就解釋了不同類型的濕地土壤中菌群結(jié)構(gòu)的相似性[23]。在門和屬水平上,微生物群落存在差異,土壤中細(xì)菌以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門為主,但在不同類群中仍存在明顯的類群豐度差異,如HW5-1中藍(lán)藻菌門的豐度較高,YWS3中變形菌門的豐度較高,YWS5中擬桿菌門的豐度較高。同時,細(xì)菌的豐度和結(jié)構(gòu)還受到植被的影響,植物多樣性可以用來預(yù)測土壤微生物群落的多樣性。黃河三角洲典型的蘆葦區(qū)、檉柳區(qū)、堿蓬區(qū)及漫灘裸地中菌群豐度表現(xiàn)出明顯的差異。根際中豐度較高的細(xì)菌包括藍(lán)藻門、變形菌門和放線菌門,其中藍(lán)藻門的平均豐度達(dá)到50%以上。

3.2 微生物群落與環(huán)境因子的相關(guān)性

4 結(jié)論

本研究利用高通量測序技術(shù)研究了我國黃河三角洲濱海濕地土壤和植物根際細(xì)菌群落的豐度和結(jié)構(gòu),揭示了環(huán)境因子與濕地土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)組成的內(nèi)在聯(lián)系,主要結(jié)論如下：

(1)濕地土壤和植物根際中優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)存在差異。土壤細(xì)菌分布以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門為主,在各樣本中合計占比高于90%；根際細(xì)菌豐度較高的為藍(lán)藻門、變形菌門、放線菌門和厚壁菌門,土壤微生物的豐度和多樣性顯著大于根際細(xì)菌,在屬水平上土壤和植物菌群結(jié)構(gòu)的差異更明顯。

(2)裸地、蘆葦、檉柳和堿蓬等不同生境類型條件下細(xì)菌的物種組成存在差異。微生物豐富度指數(shù)表明蘆葦檉柳生長區(qū)的微生物豐度高于灘涂裸地、堿蓬區(qū)和棉田區(qū),海漫灘中微生物豐度明顯高于河漫灘和泥灘。

本研究有助于了解黃河三角洲濱海濕地土壤和植物根際的細(xì)菌分布特征,研究微生物不同功能之間存在的內(nèi)在聯(lián)系,維護(hù)三角洲濕地生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性、生物多樣性和遺傳多樣性。