缺血性腦卒中患者外周血中microRNA-298水平變化及其臨床意義

劉彩云，劉麗芳，郭利芳，馬艷茹

腦卒中是一種常見的急性腦血管疾病，是腦部血管破裂或者血管阻塞使得血液不能流入大腦，從而導(dǎo)致腦組織損傷的一類疾病，具有高發(fā)病率高致死致殘率的特點(diǎn)[1-2]。微小RNA，即microRNA(miRNA)是近些年發(fā)現(xiàn)的一類長度為19～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA[3-6]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-298在缺血性腦卒中大鼠的外周血和腦組織中表達(dá)上調(diào)[7]，然而，miR-298在缺血性腦卒中患者中的表達(dá)以及其與缺血性腦卒中發(fā)病是否有關(guān)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過比較缺血性腦卒中患者和正常對(duì)照外周血中miR-298的表達(dá)差異，探討miR-298的表達(dá)水平與缺血性腦卒中嚴(yán)重程度的相關(guān)性及其作為評(píng)估缺血性腦卒中患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)生物標(biāo)志物的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2019年4月-2019年12月我院神經(jīng)內(nèi)科收治的65例缺血性腦卒中患者為觀察組，選取同期體檢健康人群50例為健康對(duì)照組。健康對(duì)照組中男性31例，女性19例，平均年齡(56±7.8)歲；觀察組男性39例，女性26例，平均年齡(55±9.1)歲。2組間性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。缺血性腦卒中的診斷按照WHO國際疾病分類標(biāo)準(zhǔn)(第九版)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行，患者至少有一項(xiàng)神經(jīng)癥狀，同時(shí)經(jīng)影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)卒中病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：①有腦卒中病史；②合并自身免疫性疾病、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病及心梗；③心肺肝腎功能不全；④嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)感染。健康對(duì)照組采用體檢、生化指標(biāo)檢查和調(diào)查問卷的方式排除腦卒中病史、惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并獲得了所有研究對(duì)象的書面知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集： 通過抽取研究對(duì)象的空腹靜脈血5 mL，并迅速保存于-80 ℃，用于抽提總RNA。缺血性腦卒中患者入院后24 h內(nèi)抽取外周血。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)：取200 μl外周血，利用miRNA提取試劑盒(康維世紀(jì)，貨號(hào)：CW0627)提取miRNA，然后按照miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(康維世紀(jì)，貨號(hào)：CW2141)的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(康維世紀(jì)，貨號(hào)：CW2142)檢測(cè)miR-298的表達(dá)。Real-time PCR擴(kuò)增在ABI Prism 7900HT Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific，美國)儀器上進(jìn)行。U6 snRNA為內(nèi)參，每個(gè)樣品同時(shí)檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔。microRNA-298的相對(duì)表達(dá)量用公式2ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。引物序列如下：miR-298 forward,5’-ACACTCAGCTGGGAGCAGAAGCAGGGAG-3’;reverse,5’-GGTGTCGTGGAGTCG-3’和U6 forward,5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’;reverse,5’-CAGGGGCCATGCTAATCTT-3’。

1.3 觀察指標(biāo)：①觀察2組吸煙及伴發(fā)疾病發(fā)生率；②觀察2組血糖、血脂水平；③觀察2組miR-298的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 2組吸煙及伴發(fā)疾病發(fā)生率比較：觀察組高血壓發(fā)生率高于健康對(duì)照組，而吸煙率以及糖尿病、高血脂發(fā)生率2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 2組吸煙及伴發(fā)疾病發(fā)生率比較[n(%)]

2.2 2組血糖、血脂水平比較：2組血糖、甘油三酯、高密度脂蛋白水平面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；觀察組總膽固醇、低密度脂蛋白水平高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 2組患者血糖、血脂水平比較

2.3 miR-298在缺血性腦卒中和健康對(duì)照組中的表達(dá)情況及其與缺血性腦卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)間的關(guān)系：檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-298在缺血性腦卒中患者和健康對(duì)照中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.559±0.08和1.942±0.09，miR-298在觀察組中的表達(dá)顯著高于在對(duì)照組(P<0.05)，見圖1(目錄后)。此外，Logistic回歸分析結(jié)果顯示，miR-298的高表達(dá)增加了缺血性腦卒中發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.82,95%CI=1.10～2.81;P<0.05)，經(jīng)性別、年齡、高血壓、高血脂、吸煙等傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因素校正后，miR-298的高表達(dá)仍然與缺血性腦卒中發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)(OR=2.01,95%CI=1.05～3.36;P<0.05)。結(jié)果表明缺血性腦卒中患者的外周血miR-298的表達(dá)水平較健康對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，并且與缺血性腦卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。

3 討論

miRNA是一類長度為19～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，他們可通過作用于靶基因從而發(fā)揮生物學(xué)功能。大量研究表明，miR-298的異常表達(dá)與人類腫瘤和阿爾茨海默癥的發(fā)生密切相關(guān)[9-10]。LIU等人利用基因芯片發(fā)現(xiàn)了miR-298在缺血性腦卒中患者中高表達(dá)[7]。然而，miR-298在缺血性腦卒中患者中的表達(dá)以及其與缺血性腦卒中發(fā)病是否有關(guān)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究通過比較miR-298在缺血性腦卒中患者和健康對(duì)照中的表達(dá)，以評(píng)價(jià)其對(duì)缺血性腦卒中診斷和預(yù)后的價(jià)值。

由于miRNA在外周血中的含量相對(duì)較低，因此real-time PCR便成為檢測(cè)外周血miRNA檢測(cè)的有效手段[11]。本研究利用real-time PCR比較了65例缺血性腦卒中患者及50例健康對(duì)照組外周血中miR-298的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-298在缺血性腦卒中患者外周血中的表達(dá)水平顯著高于其在健康對(duì)照組中的表達(dá)水平。此外，Logistic回歸分析結(jié)果顯示，miR-298的高表達(dá)增加了缺血性腦卒中發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR-298與缺血性腦卒中的發(fā)生相關(guān)。在缺血性腦卒中患者中，miR-298是否也通過作用于其靶基因Act1發(fā)揮作用，仍有待進(jìn)一步研究。

本資料所有研究對(duì)象均為中國漢族人群，并且按照嚴(yán)格的排除和納入標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，同時(shí)，觀察組和健康對(duì)照組的性別和年齡相匹配。然而，本研究仍然存在以下不足之處：①樣本例數(shù)較少，各臨床資料在2組間分布不均，結(jié)果可能存在一定的偏倚性，因此，后期有必要繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究miR-298在缺血性腦卒中患者中的作用；②需要利用生物信息學(xué)分析和功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-298在缺血性腦卒中發(fā)生中的靶基因，以明確miR-298參與缺血性腦卒中的分子機(jī)制。