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    基于標(biāo)準(zhǔn)加入法的改進(jìn)計(jì)算公式測(cè)定蘋果中毒死蜱、戊唑醇?xì)埩袅?/h1>
    2021-09-01 01:52:40覃慧麗
    現(xiàn)代農(nóng)藥 2021年4期
    關(guān)鍵詞:毒死響應(yīng)值計(jì)算公式

    武 源,覃慧麗

    (柳州市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心,廣西柳州 545006)

    毒死蜱、戊唑醇常用于蘋果病蟲害的防治,屬于蘋果病蟲害化學(xué)防治中的高頻農(nóng)藥[1]。戊唑醇主要用于枝干輪紋病、干腐病、斑點(diǎn)落葉病、褐斑病等病害的防治[2],毒死蜱常用于桃小食心蟲、蘋果綿蚜等蟲害的防治。農(nóng)藥在保障作物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量的同時(shí),也會(huì)對(duì)環(huán)境和人體產(chǎn)生一定副作用,例如戊唑醇屬于難降解農(nóng)藥,在土壤、水體中的降解半衰期大于180 d[3],容易引發(fā)農(nóng)藥再殘留問題。中高毒農(nóng)藥毒死蜱在蘋果上的檢出率高,在殘留風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)中屬于高風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥[4]。合理有效的檢測(cè)手段有助于農(nóng)藥殘留日常監(jiān)督管理,從而提升食品安全生產(chǎn)質(zhì)量,降低存在的殘留和安全風(fēng)險(xiǎn)。

    質(zhì)譜法可提供化合物的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息,由于質(zhì)譜屬于通用型檢測(cè)器,在多農(nóng)殘快速篩查領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛[5-7]。食品中農(nóng)藥殘留GC分析領(lǐng)域常見基質(zhì)效應(yīng),是指待測(cè)組分受基質(zhì)共流物的影響而導(dǎo)致響應(yīng)增強(qiáng)或抑制的現(xiàn)象[8-12]?;|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液替代溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液可以很好地解決基質(zhì)效應(yīng)帶來的定量不準(zhǔn)確的影響[13-15],但不是所有的樣品都能找到不含待測(cè)物的空白基質(zhì)[16],尤其面對(duì)能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)樣品或者待測(cè)物為內(nèi)源性物質(zhì)等復(fù)雜多樣的樣品[17-19]。

    標(biāo)準(zhǔn)加入法是在待測(cè)樣品中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),保證了樣品溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液在基質(zhì)效應(yīng)上的一致性,消除了基質(zhì)共流物對(duì)分析物的影響,是目前解決基質(zhì)效應(yīng)最為可靠有效的定量方法[20-22]。查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),標(biāo)準(zhǔn)加入法定量通常將標(biāo)準(zhǔn)工作曲線反向延長(zhǎng)至與橫坐標(biāo)延長(zhǎng)線相交,交點(diǎn)與原點(diǎn)之間的距離即為待測(cè)物的質(zhì)量濃度[23-26]?;跇?biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定樣品溶液濃度,傳統(tǒng)計(jì)算公式視待測(cè)組分的響應(yīng)值為曲線截距,且忽略了曲線截距與待測(cè)組分的響應(yīng)值之間的距離對(duì)定量結(jié)果帶來的偏差影響,所得濃度是不夠準(zhǔn)確的。筆者基于標(biāo)準(zhǔn)加入法,對(duì)比了傳統(tǒng)計(jì)算公式和改進(jìn)計(jì)算公式所得樣品含量結(jié)果的差異,以“z-比分?jǐn)?shù)”評(píng)價(jià)測(cè)得結(jié)果的滿意度,為樣品的準(zhǔn)確定量提供新的解決方案。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    提取包5982-5650CH:4 g MgSO4,1 g NaCl,1 g檸檬酸鈉,0.5 g三水合二檸檬酸二鈉及1顆陶瓷均質(zhì)子;凈化試劑管5982-5256:885 mg MgSO4,150 mg PSA,15 mg GCB,美國安捷倫公司。

    乙腈(色譜純),德國Merck公司;丙酮(色譜純),上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;乙酸乙酯(色譜純),上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;毒死蜱(純度99.89%)、戊唑醇(純度99.30%)、環(huán)氧七氯B(純度98.70%),德國Dr.Ehrenstorfer公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    7890B-7000D氣質(zhì)聯(lián)用儀、VF-1701MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25μm),美國安捷倫公司;XP26微量電子天平,瑞士Mettler Toledo公司;IKA VORTEX 4 basic渦旋振蕩器,德國IKA公司;IKA VXR basic圓周振蕩器,德國IKA公司;TTL-DCⅡ型氮吹儀,北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司;SIGMA 3-30K離心機(jī),德國SIGMA公司。

    1.3 方法

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    待測(cè)物儲(chǔ)備液:精密稱取毒死蜱、戊唑醇標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中,丙酮溶解并定容至刻線。

    內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液:精密稱取環(huán)氧七氯B標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中,乙酸乙酯溶解并定容至刻線。

    混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/mL):精密吸取適量的毒死蜱、戊唑醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于20 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容,配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    內(nèi)標(biāo)工作液(5μg/mL):精密吸取一定量的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,用乙酸乙酯配制成內(nèi)標(biāo)工作液。

    系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液:根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求,精密吸取不同體積混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用乙酸乙酯稀釋定容,配制成所需混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

    標(biāo)準(zhǔn)加入法標(biāo)準(zhǔn)曲線:準(zhǔn)確稱取若干份10 g不含待測(cè)物的空白樣品于50 mL離心管,根據(jù)1.3.2樣品前處理步驟制備好回收樣品溶液(0.02、0.05、0.1 mg/kg 3個(gè)添加水平)氮吹近干,加20μL內(nèi)標(biāo)工作液并加入1 mL從0開始遞增的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液復(fù)溶。以復(fù)溶加入標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),待測(cè)組分定量離子與內(nèi)標(biāo)定量離子響應(yīng)值之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.2 樣品前處理

    準(zhǔn)確稱取10 g待測(cè)樣品于50 mL塑料離心管中,加10 mL乙腈并加入提取包5982-5650CH,蓋上離心管蓋,振蕩器劇烈振蕩1 min后于4 200 rpm離心5 min,吸取8 mL上清液至凈化試劑管5982-5256中,立即搖散,渦旋混勻1 min,4 200 rpm離心5 min,準(zhǔn)確吸取1 mL上清液于10 mL試管中,40℃水浴中氮吹至近干,加入20μL的內(nèi)標(biāo)工作液,加入1 mL乙酸乙酯復(fù)溶,0.22μm濾膜過濾后上機(jī)測(cè)定。

    1.3.3 GC-MS/MS條件

    1.3.3.1 色譜條件

    1.3.3.2 質(zhì)譜條件

    電子轟擊源:70 eV;離子源溫度:280℃;傳輸線溫度:280℃;溶劑延遲:3 min;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM模式?;衔锊杉x子對(duì)信息見表1。

    表1 化合物定量離子對(duì)、定性離子對(duì)和碰撞能量

    2 結(jié)果與分析

    2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

    化合物質(zhì)譜分析的子離子選自其在質(zhì)譜離子源轟擊中形成的碎片離子,不同子離子抗干擾能力也有差異。優(yōu)化電壓,選擇抗干擾能力強(qiáng)、豐度值高的離子對(duì)有助于提高定量的準(zhǔn)確性和靈敏度,提高化合物在儀器上的響應(yīng)。取1μg/mL溶劑標(biāo)液進(jìn)樣,優(yōu)化化合物離子對(duì)參數(shù)。

    毒死蜱常見的離子對(duì)有313.8/285.5、313.8/257.8、196.7/107.0、313.8/193.8,其中313.8/285.5和313.8/193.8離子對(duì)響應(yīng)弱,信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他2對(duì)離子對(duì)的信噪比。通過優(yōu)化電壓得到最強(qiáng)豐度響應(yīng),313.8/257.8最適電壓為15 V,196.7/107.0最適電壓為36 V,選擇響應(yīng)最高的313.8/257.8為定量離子對(duì)。

    戊 唑 醇 離 子 對(duì) 有252.0/127.0、250.0/125.0、125.0/99.0、125.0/89.0。4對(duì)離子對(duì)中,252.0/127.0和125.0/99.0響應(yīng)較弱,不利于定量分析,故選擇250.0/125.0、125.0/89.0為確定離子對(duì)。進(jìn)一步優(yōu)化得到250.0/125.0、125.0/89.0的最佳電壓分別是25 V和16 V,選取豐度值最高的250.0/125.0為定量離子對(duì)。

    同理優(yōu)化得到環(huán)氧七氯B定量離子對(duì)為352.8/262.9,電壓為15 V,定性離子對(duì)為354.8/264.9,電壓為15 V。

    2.2 線性關(guān)系和基質(zhì)效應(yīng)

    準(zhǔn)確稱取空白樣品若干份,根據(jù)1.3.2樣品前處理步驟制備得空白基質(zhì)溶液。精密吸取1 mL凈化后的空白基質(zhì)溶液于40℃水浴氮吹近干,加入20μL的內(nèi)標(biāo)工作液,并準(zhǔn)確加入1 mL系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶,以待測(cè)組分與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值之比(y)對(duì)復(fù)溶加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(x)做基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。毒死蜱在21.86~874.4 ng/mL線性范圍內(nèi)線性良好,線性方程y=0.021 7x-0.259 1,相關(guān)系數(shù)為0.999 0;戊唑醇在24.16~966.4 ng/mL線性范圍內(nèi)線性良好,線性方程y=0.041 8x-0.236 2,相關(guān)系數(shù)為0.999 2。

    以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值考察基質(zhì)效應(yīng)(ME)[27]。由于儀器浮動(dòng)的影響,當(dāng)斜率比值為0.9~1.1,基質(zhì)效應(yīng)忽略不計(jì);當(dāng)斜率比值>1.1,為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng);當(dāng)斜率比值<0.9,為基質(zhì)抑制效應(yīng)[28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,毒死蜱ME值為7.4,戊唑醇ME值為25.9,毒死蜱和戊唑醇均為基質(zhì)誘導(dǎo)增強(qiáng)效應(yīng),且戊唑醇基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)大于毒死蜱。蘋果基質(zhì)共流物對(duì)毒死蜱和戊唑醇的誘導(dǎo)影響較大,基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液可消除內(nèi)源性和外源性共流物對(duì)分析物的影響,定量更準(zhǔn)確。對(duì)于無法得到空白基質(zhì)的樣品,標(biāo)準(zhǔn)加入法結(jié)合本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)計(jì)算公式可準(zhǔn)確獲得陽性樣品溶液濃度。

    2.3 回收率、精密度和定量限

    準(zhǔn)確稱取若干份10 g空白蘋果樣品,分別加入不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.02、0.05、0.1 mg/kg 3個(gè)添加水平),靜置30 min后,按照1.3.2樣品前處理步驟制備樣品溶液,不同添加水平樣品制備6份平行樣以考察方法可行性及穩(wěn)定性。結(jié)果表明,3個(gè)添加水平下蘋果中毒死蜱回收率在99.3%~106.0%,精密度在3.6%~4.9%;蘋果中戊唑醇回收率在96.3%~103.8%,精密度在3.3%~4.2%,回收率和精密度均符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的要求[29](表2)。

    水利樞紐工程安全監(jiān)測(cè)系統(tǒng)在設(shè)計(jì)開發(fā)中,不僅涉及多個(gè)學(xué)科,還會(huì)涉及多個(gè)專業(yè),因而在設(shè)計(jì)過程中能夠集中多個(gè)領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)。從專業(yè)知識(shí)的角度來說,水利樞紐工程安全監(jiān)測(cè)系統(tǒng)設(shè)計(jì)主要設(shè)計(jì)的專業(yè)有傳統(tǒng)的水利專業(yè)、現(xiàn)代的微電子專業(yè)、通信專業(yè)以及自動(dòng)控制專業(yè)等。水利樞紐工程安全監(jiān)測(cè)系統(tǒng)開發(fā)是一項(xiàng)整體的工程,且建成后會(huì)發(fā)揮重要的作用。

    表2 毒死蜱、戊唑醇線性方程及添加回收結(jié)果(n=6)

    以10倍信噪比對(duì)應(yīng)的添加水平確定方法定量限。根據(jù)前處理稀釋倍數(shù)及樣品稱樣量,得到蘋果中毒死蜱和戊唑醇方法定量限分別為0.003 mg/kg、0.001 mg/kg,滿足日常檢測(cè)的需要[30]。

    2.4 標(biāo)準(zhǔn)加入法改進(jìn)計(jì)算公式推導(dǎo)

    對(duì)陽性待測(cè)樣品采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行定量時(shí),以加入樣品中標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x軸),待測(cè)組分響應(yīng)值為縱坐標(biāo)(y軸)繪制陽性樣品的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1a)。常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算方式[23-26]是將標(biāo)準(zhǔn)曲線反向延長(zhǎng)至與x軸相交,交點(diǎn)與原點(diǎn)間的距離對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度即為待測(cè)組分的質(zhì)量濃度(y′=0時(shí)所對(duì)應(yīng)的x值),詳見常規(guī)式(1)。

    式中:C為從基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的待測(cè)組分溶液濃度,單位與橫坐標(biāo)一致;b′為標(biāo)準(zhǔn)加入法基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距;k′為標(biāo)準(zhǔn)加入法基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

    假設(shè)存在與測(cè)定樣品匹配的空白基質(zhì),則以此空白基質(zhì)溶液同法可配制得陰性樣品的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1b)。比較2條標(biāo)準(zhǔn)曲線可知,同類樣品基質(zhì)效應(yīng)相同,陰性基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與陽性基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的加標(biāo)質(zhì)量濃度相同,各點(diǎn)響應(yīng)值差別只有陽性樣品本底值A(chǔ)′。由于同一陽性樣品溶液中質(zhì)量濃度水平恒定,則本底濃度在相同儀器條件下的響應(yīng)值A(chǔ)′保持恒定,因此理論上2條標(biāo)準(zhǔn)曲線是斜率相等,截距不同的平行線段,截距差值即為陽性樣品的響應(yīng)值帶來的本底增量A′。故2條標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系有k′=k0,b0=b′-A′。

    色譜分析中,空白基質(zhì)應(yīng)未檢出目標(biāo)物質(zhì),即陰性基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線0點(diǎn)的響應(yīng)值A(chǔ)0=0。在陽性樣品溶液中加入從0開始遞增的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,陽性基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線0點(diǎn)的測(cè)得響應(yīng)值為A測(cè)=A′+A0=A′+0=A′。采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量,將待測(cè)物質(zhì)在儀器上的響應(yīng)A測(cè)帶入陰性基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=k0x+b0即可得出待測(cè)組分溶液濃度[31-32]。根據(jù)上述推導(dǎo)關(guān)系得改進(jìn)的式(2)。未知量k0、b0均轉(zhuǎn)化至已知k′、b′、A測(cè),陽性樣品含量可解。

    式中:A測(cè)為標(biāo)準(zhǔn)加入法陽性基質(zhì)標(biāo)曲0點(diǎn)的測(cè)得響應(yīng)值(內(nèi)標(biāo)法則為待測(cè)組分與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值之比)。

    根據(jù)“最小二乘法”原則確定回歸方程,A測(cè)為標(biāo)準(zhǔn)加入法陽性基質(zhì)標(biāo)曲0點(diǎn)的測(cè)得響應(yīng)值,與直線方程存在一定的偏離度[33-34],A測(cè)往往與b′并不重合,即|b′-A測(cè)|≠0。傳統(tǒng)計(jì)算公式以b′/k′計(jì)算樣品濃度,直接用截距b′代表陽性樣品響應(yīng)值A(chǔ)測(cè),從而忽略了b′與A測(cè)之間差值對(duì)定量結(jié)果帶來的誤差,導(dǎo)致所得濃度不夠準(zhǔn)確。改進(jìn)計(jì)算公式克服了上述不足,更好地詮釋了濃度與響應(yīng)值之間的定量關(guān)系,由此得到更準(zhǔn)確的待測(cè)組分溶液濃度。

    2.5 標(biāo)準(zhǔn)加入法的2種計(jì)算公式對(duì)結(jié)果的影響

    按照1.3.2樣品前處理步驟,以回收樣品溶液為測(cè)定溶液,氮吹近干后加入20μL的內(nèi)標(biāo)工作液,加入1 mL從0開始遞增的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以復(fù)溶加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),待測(cè)組分定量離子與內(nèi)標(biāo)定量離子響應(yīng)值之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用“z-比分?jǐn)?shù)”評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)加入法的2種計(jì)算公式定量結(jié)果的準(zhǔn)確性,詳見式(3)。

    式中:x為樣品測(cè)定值;X為指定值(本實(shí)驗(yàn)為添加水平),σ為標(biāo)準(zhǔn)差。當(dāng)|z|≤2時(shí),測(cè)得結(jié)果滿意;當(dāng)2<|z|<3時(shí),測(cè)得結(jié)果有問題(可疑);當(dāng)|z|≥3時(shí),測(cè)得結(jié)果不滿意(離群)。

    從表3看出,2種計(jì)算公式得到的毒死蜱、戊唑醇樣品含量結(jié)果的z值均小于2,測(cè)試結(jié)果均滿意;2種組分根據(jù)改進(jìn)計(jì)算公式得到的z值均小于傳統(tǒng)計(jì)算公式得到的z值,改進(jìn)算法優(yōu)于傳統(tǒng)算法。2種計(jì)算公式得到的z值在低濃度添加水平下(0.02 mg/kg)差異不顯著,但在中高濃度添加水平下(0.05、0.1 mg/kg)z值差異顯著。改進(jìn)的計(jì)算公式得到的z值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)計(jì)算公式計(jì)算的z值,與真值更接近。基于標(biāo)準(zhǔn)加入法采用改進(jìn)公式計(jì)算樣品含量,得到的樣品結(jié)果準(zhǔn)確性更高,可靠性更強(qiáng),為樣品準(zhǔn)確定量提供了新的解決方案。

    表3 標(biāo)準(zhǔn)加入法不同計(jì)算方式對(duì)定量結(jié)果的影響(n=6)

    3 結(jié) 論

    本試驗(yàn)前處理在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.113的基礎(chǔ)上,基于標(biāo)準(zhǔn)加入法建立了蘋果中毒死蜱、戊唑醇?xì)埩袅康姆治?。在?biāo)準(zhǔn)加入法定量方式上,采用2種計(jì)算公式計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示,常規(guī)和改進(jìn)計(jì)算公式均能滿足常規(guī)定量使用,但改進(jìn)計(jì)算公式得到的樣品含量準(zhǔn)確性和可靠性更高,適用于果蔬基質(zhì)中農(nóng)殘的準(zhǔn)確定量。當(dāng)前處理方法回收率滿足測(cè)定要求,操作穩(wěn)定性好。樣品中待測(cè)物質(zhì)溶液濃度在儀器上有較好的響應(yīng)時(shí),基于標(biāo)準(zhǔn)加入法結(jié)合改進(jìn)計(jì)算公式,也可用于能力驗(yàn)證樣品、特殊基質(zhì)樣品和內(nèi)源性物質(zhì)樣品的準(zhǔn)確定量。

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