基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接探討樺褐孔菌三萜類成分抗胃癌作用機(jī)制

程歡歡，宋 輝，劉博男，汲晨鋒，孫向明，李文蘭*，曲中原*

1哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院；2哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150076

胃癌是全球常見的惡性腫瘤，預(yù)后相對較差，嚴(yán)重威脅人類生命健康。超過70%的胃癌新發(fā)病例發(fā)生在發(fā)展中國家，約50%的病例發(fā)生在亞洲東部，主要集中在中國，胃癌的發(fā)病率和病死率均居中國惡性腫瘤的第2位，且發(fā)病率尚未見下降趨勢，是危害中國居民健康的主要疾病[1,2]。

樺褐孔菌(Inonotusobliquus，IO)為多孔菌科的藥用真菌，其資源主要分布于我國東部地區(qū)，以吉林、黑龍江為主。經(jīng)臨床藥理研究證實，樺褐孔菌具有廣泛的藥理作用，包括：降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗病毒、護(hù)肝作用等。16世紀(jì)時，樺褐孔菌在我國東北民間就屬于藥食兩用的佳品[3]。研究發(fā)現(xiàn)，晚期胃癌患者服用樺褐孔菌后，飯量增加、情緒提升、還可以降低病人的疼痛感[4]。研究表明，羊毛甾烷型四環(huán)三萜類化合物是樺褐孔菌的主要活性成分，質(zhì)量分?jǐn)?shù)占比約1.5%，主要包括樺褐孔菌醇、羊毛甾醇、栓菌酸等[5]。因其具有顯著的抗腫瘤作用，樺褐孔菌三萜類化合物(triterpenoids ofInonotusobliquus，IOT)可以有效的抑制腫瘤細(xì)胞增殖。本課題組前期對樺褐孔菌三萜類成分提取純化工藝及體外抗腫瘤作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明，三萜濃度為20、50、100 μg/mL的樺褐孔菌分別作用于人胃癌細(xì)胞株24和48 h，細(xì)胞生長抑制率分別為27.80%、39.20%、58.41%以及42.50%、52.70%、66.14%，純化后的樺褐孔菌三萜具有顯著抑制人胃癌細(xì)胞株生長作用(P<0.05)[6]，但樺褐孔菌三萜抗胃癌的作用靶點及機(jī)制尚未明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于多學(xué)科理論從多角度對藥物干預(yù)疾病作用靶點及機(jī)制進(jìn)行分析的新方法。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選樺褐孔菌三萜類活性化合物作用于胃癌的潛在靶點，發(fā)掘其分子機(jī)制，構(gòu)建其抗胃癌多靶點、多通路的藥理網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行分子對接驗證，為進(jìn)一步研究樺褐孔菌三萜類成分抗胃癌的作用機(jī)制及藥物開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)[7]。

1 資料與方法

1.1 候選成分的獲取與活性成分的篩選

根據(jù)查閱文獻(xiàn)報道對樺褐孔菌總?cè)祁惓煞诌M(jìn)行搜集，列為候選化合物。基于TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選樺褐孔菌總?cè)频幕钚猿煞?，設(shè)置閾值：口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-like，DL)≥0.18；利用ChemDraw軟件畫出候選成分的結(jié)構(gòu)式，將其“Sdf”格式文件上傳至SwissADME平臺進(jìn)行預(yù)測。首先，腸胃吸收為“High”，說明化合物具有較好的口服利用度。其次，類藥五原則(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)中有大于或等于2個結(jié)果為“Yes”。同時滿足以上兩個條件的化合物可以納入活性化合物范圍中。查閱文獻(xiàn)補(bǔ)充與抗胃癌相關(guān)的活性顯著的化合物，最終匯總確定樺褐孔菌三萜類化合物發(fā)揮抗胃癌的活性成分。

1.2 活性成分作用靶標(biāo)及胃癌靶標(biāo)的獲取

在TCMSP、ETCM數(shù)據(jù)庫中檢索獲取樺褐孔菌三萜類活性成分相關(guān)靶點信息，再將活性化合物的“Sdf”格式文件導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫、STITCH數(shù)據(jù)庫、PharmMapper數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置屬性為“Homo sapiens”，利用UniProt數(shù)據(jù)庫將靶基因名稱校正為官方名稱，得到樺褐孔菌三萜類活性成分的預(yù)測靶點。去重，整合得到樺褐孔菌三萜類活性成分靶點信息庫。利用GeneCards、DisGeNET、OMIM數(shù)據(jù)庫，檢索關(guān)鍵詞Gastric cancer，篩選、下載與胃癌相關(guān)的靶標(biāo)，去掉重復(fù)的靶標(biāo)。疾病靶點與活性成分靶點進(jìn)行比對，篩選出樺褐孔菌三萜活性成分與胃癌的共同靶標(biāo)。

1.3 “活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

基于Cytoscape 3.7.1軟件，將“1.1”項得到的樺褐孔菌三萜的活性成分、“1.2”項收集的活性成分抗胃癌的靶標(biāo)導(dǎo)入，構(gòu)建“活性成分-靶標(biāo)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，在網(wǎng)絡(luò)圖中，“節(jié)點(node)”代表化合物和靶點，“邊(edge)”代表2個節(jié)點之間的相互作用。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基于STRING數(shù)據(jù)庫，將“1.2”項樺褐孔菌三萜類活性成分抗胃癌靶標(biāo)導(dǎo)入，說明蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。設(shè)置“Homo Sapiens”物種，隱藏游離靶標(biāo)，設(shè)定蛋白相互作用分值為0.4，下載為TSV格式，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1，獲取相應(yīng)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系。

1.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析

將樺褐孔菌三萜類活性成分抗胃癌靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫，最終獲得作用靶標(biāo)的GO富集分析及KEGG通路富集分析，獲取與胃癌疾病相關(guān)的生物過程及通路，利用微生信平臺對通路進(jìn)行可視化分析。

1.6 成分-靶點分子對接

基于Chem3D 18.0軟件，將“1.1”項下篩選的主要活性成分“Sdf”格式導(dǎo)入進(jìn)行優(yōu)化，利用Open Babel為分子結(jié)構(gòu)加氫原子，選擇MMFF94力場加電荷、能量最小化，用AutoDcok Tools將化合物轉(zhuǎn)化為PDBQT格式文件；從PDB網(wǎng)站下載需要對接的篩選的主要蛋白晶體結(jié)構(gòu)，其中靶點蛋白的選擇遵循以下原則：①人源蛋白；②選擇分辨率高的；③優(yōu)先選擇具有原始配體的。利用AutoDock Tools處理靶蛋白和小分子配體，導(dǎo)出PDBQT格式文件；采用Vina依次將活性成分與靶蛋白進(jìn)行對接打分，并做熱圖分析?；钚猿煞峙c靶蛋白的對接模式，利用PyMol軟件進(jìn)行分析作圖。以上所用網(wǎng)址詳見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫及分析平臺Table 1 Database and Analysis Platform

2 結(jié)果

2.1 樺褐孔菌三萜類活性成分分析

通過查閱文獻(xiàn)收集得到樺褐孔菌總?cè)祁惓煞止?1個[8,9]，經(jīng)篩選其中活性成分共24個(見圖1)。檢索TCMSP得到3個活性成分：栓菌酸(trametenolic acid)、白樺脂酸(betulinic acid)、羊毛甾醇(lanosterol)；通過SwissADME平臺篩選，得到符合條件的活性成分有20個：樺褐孔菌萜A(inoterpene A)、樺褐孔菌萜B(inoterpene B)等；此外通過查閱文獻(xiàn)補(bǔ)充得到與治療胃癌高度相關(guān)的化合物1個：樺褐孔菌醇(inotodiol)[10]，樺褐孔菌三萜類活性成分基本信息見表2。

表2 樺褐孔菌三萜類活性化合物信息Table 2 Information of triterpenoid active compounds of IO

續(xù)表2(Continued Tab.2)

圖1 樺褐孔菌三萜類成分Fig.1 Components of IOT注：藍(lán)色：樺褐孔菌三萜類活性成分，紫色：樺褐孔菌三萜類非活性成分。A1：文獻(xiàn)補(bǔ)充的活性成分；A2：SwissADME平臺預(yù)測的活性成 分；A3：TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選的活性成分。Note:Blue:Triterpenoid active components of IO;Purple:Triterpenoid inactive components of IO.A1: Active ingredients supplemented by literature;A2:Active ingredients predicted by SwissADME platform;A3:Active ingredients screened by TCMSP database.

2.2 潛在靶標(biāo)預(yù)測

在TCMSP、ETCM數(shù)據(jù)庫中檢索樺褐孔菌三萜類活性成分的潛在靶標(biāo)，再通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(P>0.9)、PharmMapper數(shù)據(jù)庫(P>0.9)、STITCH數(shù)據(jù)庫，依次對活性化合物進(jìn)行目標(biāo)靶點的預(yù)測，獲取靶點共128個。GeneCards、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫中獲得與胃癌相關(guān)靶標(biāo)共3 020個。將活性成分對應(yīng)的潛在靶標(biāo)與胃癌相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行比較，篩選出樺褐孔菌三萜類活性成分抗胃癌的57個潛在作用靶標(biāo)。淡黃色為活性成分作用靶標(biāo)，綠色為疾病作用靶標(biāo)，重疊部分為活性成分作用于疾病的相關(guān)靶標(biāo)(見圖2)。

圖2 藥物-疾病靶標(biāo)Venn分析圖Fig.2 Venn analysis diagram of drug-disease targets

2.3 “活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將樺褐孔菌三萜類活性成分和靶標(biāo)等信息輸入Cytoscape 3.7.1軟件中，構(gòu)建樺褐孔菌“三萜類活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖，由圖3可看出，黃色代表樺褐孔菌三萜類成分潛在靶標(biāo)，綠色代表樺褐孔菌三萜類活性成分?；钚猿煞止?jié)點24個，靶點蛋白靶標(biāo)節(jié)點128個，節(jié)點間相互作用關(guān)系的邊689條。

圖3 活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Active ingredient-target network diagram

2.4 靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

由圖4可知，圓形節(jié)點代表靶標(biāo)，節(jié)點大小表示靶標(biāo)間相互作用程度。藍(lán)色、黃色、橙色節(jié)點分別表示靶標(biāo)間相互作用程度高、中、低。有1個與其他蛋白無相互作用關(guān)系，經(jīng)過篩選得到靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)共有節(jié)點56個，邊266條。樺褐孔菌三萜類活性成分抗胃癌可能與ALB、CASP3、MAPK1、ESR1、MAPK8等靶標(biāo)密切相關(guān)。

圖4 樺褐孔菌三萜抗胃癌作用潛在靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Network diagram of interaction between potential targets of triterpenes of IO against gastric cancer

2.5 樺褐孔菌抗胃癌靶標(biāo)的GO功能分析及KEGG通路富集分析

將藥物-疾病交集靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫后，得到GO功能分析表明：56個藥物-疾病交集靶標(biāo)影響了41個生物學(xué)過程、39個分子功能、11個細(xì)胞組成(P<0.05)。分別選取三者中最為顯著的10個過程繪制GO功能分析圖(見圖5)。樺褐孔菌三萜類活性成分通過改變DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、RNA聚合酶II特異性、氧化還原過程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式發(fā)揮藥效；KEGG分析富集得到41條通路(P<0.05)，選取前30條通路進(jìn)行可視化，如圖6所示。根據(jù)富集分析研究得出：TNF信號通路、癌癥信號通路、MAPK信號通路、Toll樣信號通路與樺褐孔菌三萜類活性成分抗胃癌的作用機(jī)制密切相關(guān)。前30條信號通路的活性成分-靶點-通路圖見圖7。

圖5 GO功能分析Fig.5 GO function analysis

圖6 KEGG富集分析圖(前30條)Fig.6 KEGG enrichment analysis chart (Top 30)

圖7 活性成分-靶點-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Network diagram of active ingredient-target-pathway interaction注：黃色：通路；粉色：活性成分；紫色：潛在靶點。Note:Yellow:Pathway;Pink:Active ingredients;Purple:Potential targets.

2.6 活性成分與核心靶點的分子對接

24個活性成分與5個核心靶點蛋白依次分子對接，小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合作用的強(qiáng)弱用結(jié)合能評價。若值小于0，說明二者能自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能越低，代表越易結(jié)合。經(jīng)PyRx對接，得到的數(shù)據(jù)經(jīng)過熱圖分析(見圖8)。據(jù)圖8對接結(jié)果顯示，MAPK1、MAPK8、NFKB1、CASP3與化合物白樺脂酸的結(jié)合能均小于-7.0 kJ/mol，ALB與化合物栓菌酸的結(jié)合能為-6.1 kJ/mol，具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。核心靶點蛋白質(zhì)選擇結(jié)合能最優(yōu)的化合物分析結(jié)合模式，具體對接過程見圖9。以上對接結(jié)果充分說明樺褐孔菌三萜類活性成分與胃癌中關(guān)鍵核心靶點有著良好的結(jié)合作用。

圖8 分子對接分?jǐn)?shù)的熱圖分析Fig.8 Thermogram analysis of molecular docking fraction

3 討論

胃癌是發(fā)病率居第二位的惡性腫瘤，已成為需要迫切解決的公共衛(wèi)生問題。目前更多的人開始關(guān)注天然食品和保健藥物，樺褐孔菌被贊譽(yù)為“西伯利亞靈芝”，因它能抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、降低癌癥復(fù)發(fā)的可能性、提升癌癥患者的耐受性、減少放療化療帶來的不適感[11]，倍受研究者青睞。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接的理論基礎(chǔ)，借助有關(guān)數(shù)據(jù)庫及繪圖軟件等工具對樺褐孔菌三萜類成分抗胃癌的作用機(jī)制進(jìn)行研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，樺褐孔菌三萜類活性成分包括：樺褐孔菌醇、白樺脂酸、栓菌酸、羊毛甾醇等24種成分。研究表明白樺脂酸對多種腫瘤細(xì)胞有明顯的抗腫瘤活性，可通過激活NF-κB起到抗腫瘤作用，且無毒副作用，還有研究表明白樺脂酸可能是通過上調(diào)Caspase-3、Cyto-3蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。羊毛甾醇、栓菌酸均可通過阻斷G0/G1細(xì)胞周期，降低癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤活性的作用[13]。栓菌酸抗腫瘤的作用與調(diào)控P糖蛋白有關(guān)[14]；Nomura等[15]發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌醇(inotodiol)可激活凋亡過程中的關(guān)鍵水解酶，促進(jìn)PARP和Caspase-3蛋白的裂解，啟動凋亡信號，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。樺褐孔菌醇可上調(diào)Bax蛋白表達(dá)、下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)和PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中共篩選出5個關(guān)鍵靶點，包括MAPK1、ALB、NFKB1、MAPK8、CASP3。研究表明，血清白蛋白(ALB)作為目前應(yīng)用反映營養(yǎng)狀況指標(biāo)之一，是血清蛋白質(zhì)中存在最多、功能最重要的成分，是人體內(nèi)重要的營養(yǎng)物質(zhì)，對胃壁具有保護(hù)作用。其血漿水平降低，表明胃腸道腫瘤術(shù)后患者營養(yǎng)狀況較差。Chen等[16]在研究營養(yǎng)干預(yù)在胃腸惡性腫瘤臨床結(jié)果的比較中得出，患者在應(yīng)用營養(yǎng)干預(yù)，接收營養(yǎng)支持治療的病人比沒有營養(yǎng)支持治療的病人血清ALB明顯升高，白蛋白水平可看作為胃癌術(shù)后獨立的預(yù)后因素。NFKB1基因在許多基因的啟動子和增強(qiáng)子中，都存在功能性的結(jié)合位點。它可以和TNF-α、IL-6和IL-8等特定位點進(jìn)行特異性結(jié)合，參與炎癥以及免疫反應(yīng)，并介導(dǎo)細(xì)胞黏附、分化、增殖、凋亡等生理過程，并在各種免疫炎癥性疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Jiang等[17]發(fā)現(xiàn)，位于NFKB1基因內(nèi)含子區(qū)的多態(tài)位點rs4648127的突變基因型CT與胃癌易感性具有顯著相關(guān)性，且能明顯降低胃癌易感的風(fēng)險。更有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[18]，65歲以上的老年人得胃癌幾率增大也與NFKB1啟動子基因多態(tài)性(-94插入/缺失ATTG)有著密切的關(guān)系。經(jīng)研究MAPK1可能是胃癌細(xì)胞中miR-217的下游靶基因，miR-217可以靶向結(jié)合MAPK1，降低MAPK1的表達(dá)水平，控制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[19]。本研究中發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌三萜類成分中的藥效物質(zhì)可以作用于MAPK1、MAPK8、MAPK10、MAPK14，并且參與了MAPK信號通路，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)；樺褐孔菌三萜活性化合物的許多抗胃癌靶點中涉及一些凋亡蛋白，如CASP3、CASP7。有研究表明，胃癌的發(fā)病原因與人胃癌組織中CASP3的低表達(dá)、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)[20]。KEGG通路分析也表明樺褐孔菌三萜類活性成分抗胃癌的作用機(jī)制與癌癥信號通路有關(guān)。凋亡通路受CASP3、CASP7、CASP9等蛋白的調(diào)控，可直接引起腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其增殖[21]。TNF信號通路是最常見的炎癥通路，胞膜上受體蛋白TNFR1可與胞外游離的配體TNF-α結(jié)合，使信號通路激活，級聯(lián)反應(yīng)隨之發(fā)生，激活凋亡蛋白Caspase-3，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，最終使細(xì)胞凋亡[22]。研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌的水提物可以使TNF-α和IL-4水平降低，并可顯著降低信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子STAT1與轉(zhuǎn)錄激活因子STAT6的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞凋亡。Toll樣受體信號通路在胃癌組織TLR4和TLR9在基因和蛋白質(zhì)水平都有強(qiáng)陽性表達(dá)，通過與配體結(jié)合，激活NF-κB通路，并且調(diào)節(jié)IL-8、IL-1和IL-6等多種促炎癥反應(yīng)基因，故Toll樣受體信號通路可以通過身體免疫系統(tǒng)的防御機(jī)制，對惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)行監(jiān)測[23]。由此推測，樺褐孔菌三萜類活性成分可作用于多靶點、多通路，從而發(fā)揮抗胃癌的作用。

分子對接作為計算機(jī)輔助藥物設(shè)計的一種主要方法，目前已被廣泛應(yīng)用于新藥研發(fā)的多個環(huán)節(jié)。一般Vina將對接分子和靶點的結(jié)合能劃分為三類：-4.0 kJ/mol<結(jié)合能<0 kJ/mol時，說明二者有結(jié)合活性；-7.0 kJ/mol<結(jié)合能<-4.0 kJ/mol，意味著有較好的結(jié)合活性；結(jié)合能<-7.0 kJ/mol說明有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。根據(jù)對接結(jié)果可知，白樺脂酸與CASP3、MAPK1、MAPK8、NFKB1各蛋白靶點結(jié)合能小于-7.0 kJ/mol，具有強(qiáng)烈的結(jié)合能力。白樺脂酸與CASP3活性位點殘基TYR204(C)、LEU168(C)、PHE256(C)形成疏水作用，與MAPK8活性位點殘基LEU110(A)形成一個氫鍵，和MET111(A)、ASN114(A)、VAL158(A)等形成疏水作用，此外還與NFKB1活性位點殘基PHE310(A)、LYS275(P)形成疏水作用。栓菌酸與ALB蛋白靶點結(jié)合能小于-4.0 kJ/mol，具有較好的結(jié)合能力，且與活性位點殘基ILE523(A)、GLU529(A)、LYS519(A)等形成疏水作用。21，24-環(huán)戊二烯羊毛甾-3β，21，25-三羥基-8-烯與MAPK1活性位點殘基MET108(A)形成兩個氫鍵，與ALA52(A)、VAL39(A)、TYR36(A)等形成疏水作用。對關(guān)鍵成分與各個蛋白質(zhì)的結(jié)合模型進(jìn)行分析可知，各關(guān)鍵活性成分均進(jìn)入各個蛋白晶體的活性位點，并與活性位點形成氫鍵或疏水作用。因此推測樺褐孔菌三萜類成分可能通過以上關(guān)鍵蛋白，調(diào)節(jié)胃癌疾病相關(guān)通路，起到改善和治療胃癌疾病的作用。

綜上，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測了樺褐孔菌三萜類活性成分抗胃癌的復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，結(jié)果表明樺褐孔菌三萜類成分抗胃癌的活性成分可能是：樺褐孔菌醇、白樺脂酸、羊毛甾醇、栓菌酸等，涉及的關(guān)鍵靶點：ALB、MAPK1、NFKB1、MAPK8、CASP3等，參與的主要信號通路：TNF信號通路、癌癥信號通路、MAPK信號通路、Toll樣受體信號通路等。最后通過分子對接驗證得出5個關(guān)鍵靶點蛋白與24個活性成分具有良好的結(jié)合作用。本文為相關(guān)作用機(jī)制的研究提供了思路和方法，為后續(xù)深入探討樺褐孔菌三萜類成分抗胃癌的作用機(jī)制提供了依據(jù)。