參苓白術(shù)散治療結(jié)直腸癌的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制及分子靶點(diǎn)探討

田婷婷，劉 璇，葉 濤，楊 柱,3，龍奉璽,3，吳文宇，唐東昕,3*

1貴州中醫(yī)藥大學(xué)；2貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院;3貴州省中醫(yī)腫瘤傳承與科技創(chuàng)新人才基地，貴陽(yáng) 550002

結(jié)直腸癌(CRC)作為目前全球最常見的第三大惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率持續(xù)增加，五年生存率一直不理想[1]。從表觀遺傳學(xué)改變來(lái)看，CRC的發(fā)生發(fā)展需要經(jīng)歷10～15年的時(shí)間，但飲食偏嗜、紅肉過(guò)多攝入、年齡增加、炎性腸病、腸道微生態(tài)失衡等危險(xiǎn)因素可快速的促進(jìn)其發(fā)展[2,3]。目前手術(shù)、放化療、靶向治療為CRC的主要治療方法，但此類治療手段存在的毒副作用不容忽視，并對(duì)患者的生活質(zhì)量帶來(lái)了極大的影響，嚴(yán)重制約了其療效。

中藥(traditional Chinese medicine，TCM)作為治療腫瘤疾病的替代藥，在治療CRC中優(yōu)勢(shì)明顯，并與放化療聯(lián)合使用可顯著提高患者1～3年的生存率。參苓白術(shù)散(SLBZP)一方出自《太平惠民和劑局方》，主要由人參(Ginseng Radix et Rhizoma)、茯苓(Poria)、白術(shù)(Rhizoma Atractylodis Macrocephalae)、白扁豆(Lablab Semen Album)、蓮子(Nelumbinis Semen)、山藥(Dioscoreae Rhizoma)、砂仁(Amomi Fructus)、薏苡仁(Coicis Semen)、桔梗(Platycodonis Radix)、甘草(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma)十味藥物組成。SLBZP一方包含大量皂苷、黃酮、甾體、多糖、三萜類等化合物。臨床上，SLBZP聯(lián)合放化療使用，可有效改善CRC患者生活質(zhì)量，提高患者免疫力，減輕放化療的毒副作用。Wang等[7]通過(guò)臨床隨機(jī)對(duì)照研究分析SLBZP聯(lián)合化療對(duì)CRC患者術(shù)后免疫功能及生活質(zhì)量的影響發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)了12周的治療后，較化療組相比中藥聯(lián)合化療顯著抑制CD3+、CD4+、CD4+/CD8+的表達(dá)、增加CD8+表達(dá)、提高KPS評(píng)分、增加對(duì)疾病的控制率(88.10%)、改善化療后毒副反應(yīng)、提高患者生活質(zhì)量。Zhang等[4]運(yùn)用SLBZP聯(lián)合mFOLFOX6方案對(duì)CRC術(shù)后患者進(jìn)行治療，顯著增強(qiáng)了機(jī)體免疫力，改善了化療后的毒副作用。人參、茯苓作為SLBZP中的君藥，主補(bǔ)人體五臟、調(diào)理脾胃氣機(jī)?，F(xiàn)代研究表明，人參主要成分人參皂甙Rb2不僅能作用于TGF-β1/ Smad信號(hào)通路抑制人CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)、粘附、EMT及轉(zhuǎn)移[5]，還可激活P53途徑，增加促凋亡因子Bax的水平，促進(jìn)HCT-116、SW620細(xì)胞的凋亡[6]；茯苓多糖(PCP)作為茯苓活性成分含量最豐富的一種(約占總成分的84%)，具有廣泛的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等生物學(xué)活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明[7]，SLBZP可有效減少M(fèi)DSC的浸潤(rùn)，改善免疫抑制的腫瘤微環(huán)境；并通過(guò)下調(diào)TGF-β1、N-cadherin的水平，上調(diào)E-cadherin減輕EMT及β-catenin活化，減輕癌變過(guò)程。

中醫(yī)藥是我國(guó)的國(guó)粹，并經(jīng)歷代醫(yī)療實(shí)踐者不斷檢驗(yàn)、發(fā)展和完善。中藥講究君臣佐使，臨床組方常由多味藥物配伍而成。這些復(fù)雜的藥物多具有多活性成分、多作用靶點(diǎn)、多通路調(diào)控的特點(diǎn)，可作為治療復(fù)雜疾病的理想選擇，但如何較為清晰、客觀的挖掘分析各藥物活性成分的分子機(jī)制及相互作用，成了目前限制我國(guó)醫(yī)藥發(fā)展的巨大問(wèn)題。因此，為了解決祖國(guó)醫(yī)學(xué)的發(fā)展中面臨問(wèn)題，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中藥藥效的方法便應(yīng)運(yùn)而生。它作為一種系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)分析與藥理學(xué)結(jié)合的新方法，可用于通過(guò)化合物-靶標(biāo)-疾病網(wǎng)絡(luò)闡明藥物活性成分的協(xié)同作用，預(yù)測(cè)在分子水平上通過(guò)多靶點(diǎn)多通路治療疾病的潛在機(jī)制，了解基因、蛋白、疾病之間的相互作用關(guān)系，為復(fù)雜中藥方劑的藥理研究提供了新的可能。

在本次研究中，使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析SLBZP的活性成分治療CRC的分子靶點(diǎn)和機(jī)制。并通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取、篩選CRC患者和健康個(gè)體之間的差異表達(dá)基因來(lái)獲得CRC相關(guān)靶標(biāo)，通過(guò)GO、KEGG分析得到SLBZP治療CRC的潛在作用機(jī)制。

1 資料及方法

1.1 SLBZP有效成分篩選

借助中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)，并根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-like，DL)≥0.18進(jìn)行篩選[8]。得到SLBZP藥物活性成分190種，其中人參22種、茯苓15種、白術(shù)7種、白扁豆1種、蓮子11種、山藥16種、砂仁10種、薏苡仁9種、桔梗7種、甘草92種。

1.2 確定SLBZP潛在靶點(diǎn)

將190種候選化合物導(dǎo)入到DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中(https://www.drugbank.ca/)獲取與SLBZP相應(yīng)的靶標(biāo)。除去44個(gè)與任何靶標(biāo)無(wú)關(guān)的化合物后，最終選擇了146個(gè)化合物。并收集了146種化合物的相關(guān)靶點(diǎn)，確定了762個(gè)靶點(diǎn)，其中人參99種、茯苓18種、白術(shù)17種、白扁豆21種、蓮子188種、山藥66種、砂仁43種、薏苡仁27種、桔梗70種、甘草213種。除去重復(fù)后，總共收集了255個(gè)靶標(biāo)。

1.3 CRC相關(guān)靶點(diǎn)確定

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲得CRC患者的差異表達(dá)基因，系列：GSE25070，樣品：GSM615865、GSM615866、GSM615867、GSM615868、GSM615869、GSM615870、GSM615871、GSM615872、GSM615873、GSM615874、GSM615875、GSM615876、GSM615877、GSM615878、GSM615879、GSM615880、GSM615881、GSM615882、GSM615883、GSM615884、GSM615885、GSM615886、GSM615887、GSM615888、GSM615889、GSM615890、GSM615891、GSM615892、GSM615893、GSM615894、GSM615895、GSM615896、GSM615897、GSM615898、GSM615899、GSM615900、GSM615901、GSM615902、GSM615903、GSM615904、GSM615905、GSM615906、GSM615907、GSM615908、GSM615909、GSM615910、GSM615911、GSM615912、GSM615913、GSM615914、GSM615915、GSM615916。P<0.05 和| log 1(倍數(shù)變化)|的基因> 1個(gè)被認(rèn)為具有明顯的差異表達(dá)和CRC相關(guān)靶標(biāo)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Cytoscape 3.5.1 軟件可視化SLBZP成分靶點(diǎn)-CRC靶點(diǎn)群網(wǎng)絡(luò)。從蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)(DIP,Database of Interacting Protein)，生物通用交互數(shù)據(jù)集庫(kù)(BioGRID，database of protein and genetic interaction)，人蛋白參考數(shù)據(jù)庫(kù)(HPRD，human protein reference database)，IntAct 分子相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)(IntAct，IntAct molecular interaction database)，分子相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)(MINT，molecular interaction database)，生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)(BIND)中獲取蛋白相互作用關(guān)系，并借助Cytoscape 3.5.1插件 Bisogenet構(gòu)建SLBZP與CRC蛋白質(zhì)相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)合并

利用Cytoscape軟件合并SLBZP的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)及CRC相關(guān)靶點(diǎn)。通過(guò)Cytoscape插件CytoNCA計(jì)算節(jié)點(diǎn)度值(degree centrality，DC)及中間性(betweenness centrality，BC)，篩選出交互的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)中重要的靶點(diǎn)。

1.6 生物信息學(xué)分析

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov，v6.8)進(jìn)一步分析SLBZP-CRC靶點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程及作用機(jī)制。根據(jù)矯正后P<0.05篩選，選擇了前20個(gè)GO功能類別及顯著富集的KEGG信號(hào)通路。并構(gòu)建了基因途徑網(wǎng)絡(luò)以篩選SLBZP治療CRC的關(guān)鍵靶基因。

2 結(jié)果

2.1 化合物-靶點(diǎn)篩選

190種SLBZP化合物(見表1)被選作最終候選活性成分。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中確定了611個(gè)與CRC相關(guān)的目標(biāo)。如圖1所示，并通過(guò)火山圖及熱圖形式顯示差異基因的分布情況，其中紅色表示上調(diào)基因，綠色表示下調(diào)基因。

表1 SLBZP有效成分Table 1 Active ingredients of SLBZP

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

圖1 差異基因表達(dá)熱圖(左)、火山圖(右)Fig.1 Differential gene expression heat map (left) and volcano map (right)注：在熱圖中，橫坐標(biāo)表示分組，縱坐標(biāo)表示差異基因，其中對(duì)照組在前，模型組在后；火山圖中，橫坐標(biāo)代表基因表達(dá)的倍數(shù)變化，縱坐標(biāo)代表基因表達(dá)變化的統(tǒng)計(jì)顯著性。紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因。Note:In the heat map,the abscissa represents the grouping,and the ordinate represents the differential gene,where the control group is in the front and the model group is the back;in the volcano chart,the abscissa represents the fold change of gene expression,and the ordinate represents the statistically significant change in gene expression Sex.Red represents up-regulated genes,and green represents down-regulated genes.

2.2 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

將篩選出的化合物與差異基因互相映射，在SLBZP所有活性成分中，有28個(gè)化合物可調(diào)控與CRC相關(guān)靶點(diǎn)。故構(gòu)建SLBZP化合物-CRC差異基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示，該網(wǎng)絡(luò)包含59個(gè)點(diǎn)(SLBZP中的28個(gè)化合物和31個(gè)差異基因)和70條邊，表明SLBZP可通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)治療CRC。其中槲皮素(21個(gè)靶點(diǎn))、山奈酚(5個(gè)靶點(diǎn))、β-胡蘿卜素(5個(gè)靶點(diǎn))、豆甾醇(4個(gè)靶點(diǎn))、異黃酮(4個(gè)靶點(diǎn))、薯蕷皂苷元(3個(gè)靶點(diǎn))作用于多個(gè)靶點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冊(cè)诰W(wǎng)絡(luò)中占有重要位置，可能是SLBZP的關(guān)鍵活性化合物。

圖2 SLBZP-CRC差異基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 SLBZP-CRC differential gene network diagram注：外圈紫色代表差異基因，淺綠色：山藥；深綠色：甘草；紅色：多味草藥共同成分；黃色：茯苓；玫紅色：蓮子；深藍(lán)色：桔梗；淺紅色：砂仁；淡藍(lán)色：薏苡仁；金黃色：人參；淡紅色：白扁豆。Note:The outer ring purple represents the differential gene;Light green:Dioscoreae Rhizoma;Dark green:Glycyrrhizae Radix et Rhizoma;Red:Common ingredients of various herbs;Yellow:Poria;Rose red:Nelumbinis Semen;Dark blue:Platycodonis Radix;Light red:Amomi Fructus;Light blue:Coicis Semen;Golden yellow:Ginseng Radix et Rhizoma;Light red:Lablab Semen Album.

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)調(diào)控著大規(guī)模的生物過(guò)程，PPI所獲得的網(wǎng)絡(luò)在大多數(shù)生物學(xué)功能和過(guò)程中非常重要，且大多數(shù)蛋白質(zhì)的功能需要通過(guò)相互作用來(lái)激活[9]。因此，如圖3所示，使用PPI數(shù)據(jù)可視化SLBZP預(yù)測(cè)目標(biāo)和CRC相關(guān)目標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)。PPI網(wǎng)絡(luò)中，包含1 130個(gè)節(jié)點(diǎn)及565個(gè)邊，其中，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表著不同的蛋白，565條邊代表565種相互作用關(guān)系。

圖3 SLBZP-CRC差異基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 SLBZP-CRC differential gene network diagram注：確定SLBZP調(diào)控CRC的候選目標(biāo)，A.SLBZP預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與CRC相關(guān)靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)；B.根據(jù)DC大于61，從圖A中提取的重要蛋白質(zhì)的PPI網(wǎng)絡(luò)；C.根據(jù)BC大于100，從圖B中提取的SLBZP用于治療CRC的候選靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。Note:To determine the candidate targets of SLBZP regulating CRC,A.SLBZP predicts the interaction network between target and CRC-related target protein;B.According to DC greater than 61,the PPI network of important proteins extracted fromFig.A;C.According to the BC is greater than 100,the SLBZP extracted from Figure B is used to treat the CRC candidate target PPI network.

2.4 確定SLBZP調(diào)控CRC的候選靶點(diǎn)

為了深入分析SLBZP調(diào)控CRC的作用機(jī)制，將SLBZP-CRC相關(guān)靶基因合并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)由1 130個(gè)節(jié)點(diǎn)和17 529個(gè)邊組成，根據(jù)Li[10]、Zhang等[11]研究，認(rèn)為在所有蛋白的degree中，超過(guò)中位數(shù)兩倍的為樞紐蛋白，故本研究通過(guò)各個(gè)蛋白degree，取大于DC、BC中位數(shù)兩倍的值作為核心蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)，故DC>61，BC>100。如圖3B所示。根據(jù)DC大于61，構(gòu)建了針對(duì)SLBZP調(diào)控CRC的重要目標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，其中包含166個(gè)節(jié)點(diǎn)和8 524個(gè)邊。根據(jù)BC大于100，進(jìn)一步篩選候選目標(biāo)，得到69個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)，確定為SLBZP最終調(diào)控CRC的69個(gè)靶基因，如圖3C所示。

2.5 GO、KEGG富集分析

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)31個(gè)差異基因進(jìn)行GO和KEGG信號(hào)通路富集分析，基于分子生物學(xué)功能(molecular function，MF)、生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞學(xué)組分(cellular components，CC)分析了候選靶點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程。如圖4A所示，根據(jù)FDR<0.05，篩選前面富集最顯著的生物學(xué)過(guò)程，其中BP有2個(gè)，CC有2個(gè)，MF有1個(gè)，其中紅色代表上調(diào)，藍(lán)色代表下調(diào)。如圖4B所示，5種不同顏色代表不同的生物學(xué)過(guò)程，在這些生物學(xué)過(guò)程中，與之相關(guān)的基因有18個(gè)，紅色代表上調(diào)基因，藍(lán)色代表下調(diào)基因，其中顏色越深代表調(diào)節(jié)越顯著。

圖4 SLBZP治療CRC的候選目標(biāo)的GO分析Fig.4 GO analysis of the candidate targets of SLBZP for the treatment of CRC注：根據(jù)FDR <0.05富集前面最顯著的5個(gè)GO功能類別。圖A中外圈弧形代表各個(gè)生物學(xué)功能，弧形中的各圓點(diǎn)代表基因，其中紅色代表上調(diào)，藍(lán)色代表下調(diào)；內(nèi)圈中的弧形代表基因富集的顯著性，弧形越高，富集越顯著;Z-Score越高，上調(diào)基因越多。圖B中，右邊部分根據(jù)顏色不同代表不同的生物學(xué)過(guò)程，左邊部分根據(jù)顏色不同代表各個(gè)基因所參與的生物學(xué)過(guò)程，紅色代表上調(diào)基因，藍(lán)色代表下調(diào)基因。Note:According to FDR <0.05,the top 5 most significant GO functional categories are enriched.In Figure A,the outer circle arc represents each biological function,and the dots in the arc represent genes,where red represents up-regulation and blue represents down-regulation;the arc in the inner circle represents the significance of gene enrichment,the higher the arc,the more significant the enrichment;the higher the Z-Score,the more up-regulated genes.In Figure B,the right part represents different biological processes according to different colors,and the left part represents the biological processes involved in each gene according to different colors.Red represents up-regulated genes,and blue represents down-regulated genes.

通過(guò)KEGG途徑分析得出了在治療CRC過(guò)程中受SLBZP顯著影響的信號(hào)途徑如圖5所示。根據(jù)P<0.05確定了20個(gè)顯著富集的途徑，包括化學(xué)致癌、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、IL-17、沙門氏菌感染、腫瘤壞死因子等。

圖5 SLBZP治療CRC的KEGG信號(hào)通路Fig.5 KEGG signal pathway of SLBZP in the treatment of CRC注：根據(jù)P<0.05富集前面最顯著的20條通路，橫坐標(biāo)代表基因數(shù)目，縱坐標(biāo)代表信號(hào)途徑，顏色代表P值。Note:According to P<0.05,the 20 most significant pathways in the front are enriched.The abscissa represents the number of genes,the ordinate represents the signal pathway,and the color represents the P value.

2.6 基因途徑網(wǎng)絡(luò)分析

基于顯著富集的信號(hào)通路和調(diào)控這些通路的基因構(gòu)建了基因-通路網(wǎng)絡(luò)，如圖6所示。利用Cytoscape 3.5.1軟件，通過(guò)中間性(BC)對(duì)這20條通路和23個(gè)基因進(jìn)行拓?fù)浞治觥D中正方形代表靶基因，V形代表網(wǎng)絡(luò)中的信號(hào)通路。網(wǎng)絡(luò)圖表明，F(xiàn)OS、IL-1B具有最大的 BC，為核心基因，MMP9、VEGFA、ADH1C、STAT1、ADH1A、CCND1、CXCL2、CLAL1、IL-1A等是SLBZP途徑網(wǎng)絡(luò)中治療CRC的關(guān)鍵基因。它們可能是SLBZP治療CRC的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖6 SLBZP調(diào)控CRC的靶點(diǎn)-途徑網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Target-pathway network of SLBZP in the regulation of CRC注：對(duì)20條通路和23個(gè)基因進(jìn)行拓?fù)浞治?，并以BC為中心。圖中綠色方塊代表靶基因，紅色V形代表信號(hào)通路。圖形尺寸大小代表中間性的大小。Note:Topological analysis was performed on 20 pathways and 23 genes,with BC as the center.The green square in the Figure represents the target gene,and the red V-shape represents the signal pathway.The size of the Figure represents the size of the intermediateness.

3 討論

中醫(yī)獨(dú)特的理念經(jīng)歷了數(shù)千年的發(fā)展和傳承，常用于各種疾病的預(yù)防和治療。中藥復(fù)方通常為多種草藥根據(jù)君、臣、佐、使配伍運(yùn)用，達(dá)到協(xié)同增效、藥到病所、扶正祛邪的目的。CRC屬于中醫(yī)“臟毒”“腸風(fēng)”“腸蕈”“鎖肛痔”“癥瘕”“積聚”等范疇，多因正虛邪實(shí)，寒、痰、濕、毒、瘀等凝結(jié)成癰，下聚于大腸而發(fā)病。治療常以扶正祛邪、健脾益氣、清熱利濕為主，實(shí)現(xiàn)毒瘀積聚消散，機(jī)體正氣充沛，改善疾病癥狀，提高生活質(zhì)量的目的。SLBZP作為健脾滲濕、扶正固本的經(jīng)典方劑，臨床常用于潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的治療，并可聯(lián)合放化療顯著增強(qiáng)CRC患者的免疫功能，減輕腸道炎性反應(yīng)，優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)等。中醫(yī)治病講究整體觀念，著眼于機(jī)體整體功能的恢復(fù)和病因的消除。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念一經(jīng)提出，便快速的與中藥復(fù)方相結(jié)合進(jìn)行研究，可較為全面的闡明中醫(yī)藥治療疾病的整體觀念，分析中藥復(fù)方復(fù)雜的作用機(jī)制。因此，在多種數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)的支持下，利用生物信息學(xué)手段分析中藥復(fù)方復(fù)雜的藥用成分及作用機(jī)制，使藥物的具體功效顯得清晰明了。

在本研究中，根據(jù)OB、DL篩選出了SLBZP的190種化合物及255個(gè)靶基因，并通過(guò)與CRC患者和健康個(gè)體之間的611個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行合并取交集。根據(jù)FDR<0.05、logFC>1，最終確定SLBZP與CRC相關(guān)基因31個(gè)。構(gòu)建了SLBZP化合物-CRC靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明，SLBZP的大多數(shù)化合物可調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn)，如槲皮素、山奈酚、豆甾醇分別作用于21個(gè)、5個(gè)、4個(gè)靶點(diǎn)，它們?cè)诰W(wǎng)絡(luò)中占有重要位置，所以，很可能是SLBZP的關(guān)鍵活性化合物。雖然各個(gè)單味藥的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)數(shù)量不同，但作用靶點(diǎn)有諸多重復(fù)。不難得出SLBZP的多種活性成分具有協(xié)同增效調(diào)控靶點(diǎn)的作用。槲皮素作為目前研究最為分布廣泛的類黃酮之一，其強(qiáng)大的抗氧化應(yīng)激及抗炎活性已得到充分證明，并被認(rèn)為在治療和預(yù)防糖尿病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病等方面發(fā)揮重要作用。就對(duì)腫瘤的作用而言，槲皮素可調(diào)節(jié)多種生物途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管新生、防止腫瘤細(xì)胞的增殖。研究表明[12]，槲皮素作為β-catenin有效的抑制劑，可在CRC SW480細(xì)胞中誘導(dǎo)Wnt/β-catenin的下調(diào)，防止CRC的發(fā)展進(jìn)程。Hu等[13]通過(guò)制備槲皮素納米顆粒制劑(35 nm)研究其對(duì)膀胱癌腫瘤微環(huán)境的影響發(fā)現(xiàn)，槲皮素顆粒制劑能增加藥物對(duì)腫瘤屏障的滲透性，顯著降低腫瘤中的活性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)及膠原量，使腫瘤組織中的膠原蛋白含量正?；_(dá)到抗腫瘤的目的。山萘酚是存在于不同植物物種中的天然黃酮醇，大量的體外實(shí)驗(yàn)證明了山奈酚具有顯著的抗炎作用，并可通過(guò)阻滯腫瘤細(xì)胞周期、防止腫瘤血管新生、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、防止腫瘤細(xì)胞遷移等方式抑制腫瘤的發(fā)展[14]。但是，因藥物在體內(nèi)的利用度通常受到轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通透性、親脂性、腸系膜結(jié)構(gòu)、腸上皮細(xì)胞輸送等因素的影響，使山奈酚具有較低的口服利用度，故限制了其作為抗癌劑的使用，但是據(jù)報(bào)道發(fā)現(xiàn)山萘酚與槲皮素聯(lián)合使用可通過(guò)阻斷槲皮素的外排，顯著增強(qiáng)槲皮素的抗癌作用，與順鉑聯(lián)合使用可顯著增加其對(duì)細(xì)胞的毒性作用[15]。豆甾醇作為抗癌候選藥，也顯示出顯著的抗癌作用。其可通過(guò)破壞TNF-α-VEGFR-2軸抑制腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)的形成，有效的下調(diào)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，巨噬細(xì)胞募集和腫瘤血管生成，實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的[16]。中藥成分復(fù)雜，盡管網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能較全面的分析中藥的化學(xué)成分及作用機(jī)制，但各方中的總有效成分及相互作用后的協(xié)同效應(yīng)仍不能解決。而藥物治療疾病均是多成分共同作用的結(jié)果。在本次研究中，槲皮素、山奈酚、豆甾醇調(diào)節(jié)了CRC的大部分相關(guān)靶點(diǎn)，且均具有抗炎、抗腫瘤的特性，因此可將他們視為SLBZP的具有代表性的化合物。

將SLBZP預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和CRC相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行合并，通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行結(jié)構(gòu)化，為了更準(zhǔn)確的分析SLBZP與CRC共同靶點(diǎn)與相關(guān)蛋白的相互作用關(guān)系，設(shè)置了包括DC、BC在內(nèi)的2個(gè)參數(shù)來(lái)篩選節(jié)點(diǎn)并構(gòu)建新的網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，SLBZP治療CRC相關(guān)靶點(diǎn)與其他蛋白交互作用強(qiáng)，其對(duì)CRC的治療可能與其他蛋白的相互作用協(xié)同發(fā)揮調(diào)控作用。

通過(guò)GO富集分析SLBZP針對(duì)CRC靶點(diǎn)在BP、CC、MF中的富集情況。結(jié)果表明SLBZP調(diào)節(jié)了某些生物學(xué)過(guò)程，例如細(xì)胞外基質(zhì)分解、膠原分解代謝過(guò)程、酒精脫氫酶活性等有關(guān)。上皮到間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在胚胎發(fā)生和癌變中均起關(guān)鍵作用。就腫瘤而言，EMT與癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥性、預(yù)后差等有關(guān)。EMT通常是由TGF-β等細(xì)胞因子誘導(dǎo)的，通常TGF-β通過(guò)激活幾種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)和磷酸化β-catenin蛋白，降低E-cadherin-β-catenin(Eβ)復(fù)合物的濃度，破壞細(xì)胞間的黏附[17]。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在癌癥發(fā)展過(guò)程中會(huì)經(jīng)歷組成和結(jié)構(gòu)的急劇變化，腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)富含膠原I和纖連蛋白等，并通過(guò)LOX介導(dǎo)的膠原交聯(lián)從隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)重組為對(duì)齊的網(wǎng)絡(luò)，以此增加ECM的密度，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和繁殖，增加腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲，還常常導(dǎo)致腫瘤對(duì)放射療法的抵抗，這種細(xì)胞外基質(zhì)的重塑可直接影響癌癥的進(jìn)程[16]。而膠原蛋白和纖連蛋白在內(nèi)的纖維狀ECM蛋白的沉積和交聯(lián)增加，EMT導(dǎo)致的細(xì)胞間黏附減少，使細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞間粘附不平衡也是癌癥進(jìn)展的基礎(chǔ)。全球范圍內(nèi)約有3.6%的癌癥是由飲酒導(dǎo)致的，酒精可與包括CRC在內(nèi)的消化道惡性腫瘤建立密切的聯(lián)系，因此國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將酒歸為人類致癌物的第一類[18]。酒精致癌機(jī)理為：干擾DNA的合成和修復(fù)；促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)基因突變；改變代謝途徑；大量消耗視黃酸使組織分化低、變性高，進(jìn)入惡變前狀態(tài)等。在CRC患者中，血清中乙醇脫氫酶(ADH)的活性較健康粘膜顯著增高，醛脫氫酶(ALDH)活性卻顯著降低，兩者活性出現(xiàn)異常失衡的情況，導(dǎo)致大量毒性乙醛的產(chǎn)生[19]。而SLBZP可以通過(guò)干預(yù)這些生理、病理過(guò)程預(yù)防腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

中藥以多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的優(yōu)勢(shì)治療疾病。復(fù)方SLBZP也具有相同的特性，以多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的方法治療CRC。在本研究中，包括化學(xué)致癌、沙門氏桿菌感染等信號(hào)通路在內(nèi)的20條KEGG信號(hào)通路得到了顯著的富集。由于飲食習(xí)慣及職業(yè)危害等，化學(xué)致癌所導(dǎo)致的CRC發(fā)病一直在增加。在高溫(>130 ℃)烹飪或經(jīng)空氣污染過(guò)的食物，通常會(huì)產(chǎn)生多環(huán)芳烴(PAH)、雜環(huán)胺(HCA)、N-亞硝基化合物(NOC)、霉菌毒素(黃曲霉毒素)和丙烯酰胺等致癌物，作為CRC潛在的危險(xiǎn)因素急需被人們認(rèn)識(shí)[20]。大多數(shù)流行病學(xué)研究觀察均得出HCA攝入與CRC呈正相關(guān)，其誘變CRC相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)增加了30%。硝酸鹽作為添加在食物制品中的有效的防腐劑不僅可阻止肉毒桿菌的生長(zhǎng)，還能增強(qiáng)加工肉的顏色和風(fēng)味。但越來(lái)越多的證據(jù)表明其可導(dǎo)致內(nèi)源性NOC形成，發(fā)揮強(qiáng)烈的致癌作用。NOC其主要致癌機(jī)制為增加腸道異常隱窩灶(ACF)及粘液耗竭灶(MDF)的產(chǎn)生，使腸道上皮細(xì)胞DNA突變，促進(jìn)CRC大發(fā)生。隨著高通量測(cè)序的發(fā)展，腸道菌群與CRC的關(guān)系正在被揭示。大量研究認(rèn)為，腸道菌群結(jié)構(gòu)的紊亂，病原可通過(guò)引發(fā)腸道慢性炎癥反應(yīng)改變細(xì)胞生物學(xué)，成為CRC發(fā)展的重要誘因。每年大約有9 000多萬(wàn)人感染沙門氏菌，并有超過(guò)2 500種不同血清型的腸沙門氏菌亞種存在于腸道中[21]。沙門氏菌影響著與腫瘤相關(guān)的多種信號(hào)途徑，其通過(guò)在細(xì)胞中分泌的效應(yīng)蛋白激活A(yù)KT和ERK途徑，而這些途徑在許多癌癥中通常也被激活。在Wnt信號(hào)通路中，沙門氏菌效應(yīng)無(wú)毒蛋白A(AvrA)可通過(guò)T3SS轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，在AvrA的去泛素化酶活性作用下防止β-catenin降解，促進(jìn)β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)大量募集，通過(guò)與TCF/LEF相結(jié)合，下調(diào)原癌基因MYC、CCND1的表達(dá)，同時(shí)，AvrA可通過(guò)激活A(yù)KT，使絲氨酸上的β-catenin磷酸化以進(jìn)一步促進(jìn)核β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)[22]。綜上所述，化學(xué)致癌、腸道炎癥、病原菌數(shù)量增加等因素，均是CRC發(fā)展的重要因素。SLBZP作為健脾益氣的經(jīng)典方，可以促進(jìn)有效增加機(jī)體抗炎因子表達(dá)，增強(qiáng)免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)腸道菌群，保護(hù)腸上皮細(xì)胞免受損傷，防止CRC的發(fā)展。在本研究中，上述途徑作為顯著富集并與CRC密切相關(guān)的信號(hào)通路，表明與CRC發(fā)生有關(guān)的途徑的調(diào)控可能是SLBZP治療CRC的機(jī)制之一。此外，SLBZP可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他途徑起作用，包括TNF途徑，Toll樣受體途徑、IL-17途徑等。

本研究還構(gòu)建了基因通路網(wǎng)絡(luò)以研究SLBZP針對(duì)CRC的關(guān)鍵靶基因。結(jié)果表明FOS、IL-1B具有最大BC，它可能是核心靶點(diǎn)。其他前9個(gè)基因(MMP9、VEGFA、ADH1C、STAT1、ADH1A、CCND1、CXCL2、CLAL1、IL-1A)被選為關(guān)鍵靶基因。FOS作為CRC轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，位于人類14q21-31染色體上，編碼核蛋白c-Fos。單獨(dú)的c-Fos蛋白沒(méi)有生理功能，必須與c-Jun結(jié)合形成具有轉(zhuǎn)錄激活活性的異二聚體(AP-1)，AP-1與細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān)，c-Fos和c-Jun的表達(dá)在正常組織中低，在許多惡性腫瘤和癌變過(guò)程中高。Chen等[23]為了明確在FOS影響下機(jī)體CRC的易感性，分析了c-Fos蛋白在16例CRC患者癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，CRC組織中c-Fos蛋白的表達(dá)水平顯著增加，存活率顯著降低。炎癥作為癌變的各階段的影響因素，越來(lái)越引起重視。有不少研究表明，經(jīng)常服用非甾體類抗炎藥可顯著降低患CRC的風(fēng)險(xiǎn)。這也間接證明了炎癥反應(yīng)促進(jìn)了CRC的發(fā)生。IL-1B(IL-1β)作為促炎的“警報(bào)”因子，在炎癥及癌癥早期便被激活，CRC患者中IL-1β表達(dá)水平出現(xiàn)顯著升高，并與疾病的嚴(yán)重程度、預(yù)后有關(guān)。與大部分其他腫瘤疾病，CRC是血管高度生成的腫瘤，血管的高效率生成是提高CRC細(xì)胞存活、增殖、轉(zhuǎn)移的重要因素。而IL-1β/IL-6途徑可通過(guò)刺激潛在促血管生成因子COX-2的表達(dá)，促進(jìn)血管的新生，刺激腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且三者的表達(dá)有顯著的相關(guān)性，COX-2的過(guò)度表達(dá)受IL-1β、IL-6顯著升高調(diào)控[24,25]。

本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了SLBZP對(duì)CRC的作用機(jī)理和分子靶點(diǎn)。槲皮素(21個(gè)靶點(diǎn))、山奈酚(5個(gè)靶點(diǎn))、β-胡蘿卜素(5個(gè)靶點(diǎn))、豆甾醇(4個(gè)靶點(diǎn))、異黃酮(4個(gè)靶點(diǎn))、薯蕷皂苷元(3個(gè)靶點(diǎn))作用于多個(gè)靶點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冊(cè)诰W(wǎng)絡(luò)中占有重要位置，可能是SLBZP的關(guān)鍵活性化合物。因此，SLBZP可能通過(guò)以上關(guān)鍵化合物起作用，進(jìn)一步影響特定的生物學(xué)過(guò)程，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，并在抑制炎性反應(yīng)，防止化學(xué)致癌，優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)等途徑中發(fā)揮治療作用。FOS、IL-1B、MMP9、VEGFA、ADH1C、STAT1、ADH1A、CCND1、CXCL2、CLAL1、IL-1A是SLBZP治療CRC的關(guān)鍵基因，也進(jìn)一步驗(yàn)證了中藥復(fù)方可多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療復(fù)雜疾病的優(yōu)勢(shì)。