FK506、腎功能指標(biāo)及單個核細(xì)胞計數(shù)判斷腎移植患者尿BKV DNA 陽性的價值

黃思聰， 石永杰， 嘉紅云

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510260）

有研究結(jié)果顯示，10%～68%的腎移植患者會因使用免疫抑制劑導(dǎo)致BK病毒（BK virus，BKV）被激活，其中1%～10%的患者會出現(xiàn)BKV相關(guān)腎病，而在發(fā)生BKV相關(guān)腎病的患者中，有50%會發(fā)生移植腎功能喪失，因此BKV是導(dǎo)致腎移植失敗的重要因素[1]。尿BKV DNA陽性的出現(xiàn)時間早于血BKV DNA，因此尿BKV DNA定量檢測是目前臨床監(jiān)測BKV激活的首選方法[2]。目前，常用的國產(chǎn)BKV DNA檢測試劑一般使用外源性內(nèi)標(biāo)，不參與尿液DNA提取過程，容易忽略因核酸提取效率過低而造成的假陰性。有研究結(jié)果顯示，高水平FK506[3]、淋巴細(xì)胞百分比（the percentage of lymphocyte，LYMPH%）降低[4]是促進(jìn)BKV活化的風(fēng)險因素，而BKV活化的腎移植患者血尿素及肌酐（creatinine，Cr）顯著高于BKV陰性患者[5-7]。因此，本研究擬探討血FK506、尿素和Cr水平及單個核細(xì)胞計數(shù)判斷尿BKV DNA陽性的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年5月—2020年8月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腎移植患者197例?；颊咭浦残g(shù)后使用三聯(lián)免疫抑制方案：FK506+霉酚酸酯或麥考酚鈉+激素，F(xiàn)K506用量為0.15～0.3 mg/kg、2次/d，根據(jù)血藥濃度調(diào)整劑量；術(shù)后3個月，F(xiàn)K506靶濃度為8～9 ng/mL，用藥期間每2周監(jiān)測1次。按照本研究所用檢測試劑的分析性能，以尿BKV DNA≥2.0×103拷貝/mL為BKV陽性組，＜2.0×103拷貝/mL為BKV陰性組。BKV陽性組患者84例，其中男58例、女26例，年齡（41.49±0.97）歲。BKV陰性組患者113例，其中男74例、女39例，年齡（41.44±1.08）歲。另選取21例術(shù)后3～6個月內(nèi)多次檢測尿BKV DNA，并首次出現(xiàn)陰性轉(zhuǎn)陽性的患者進(jìn)行配對比較。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有惡性腫瘤及白血病病史患者；（2）患嚴(yán)重感染性疾病者，如人類免疫缺陷病毒感染、正處于病毒復(fù)制期的肝炎病毒感染者；（3）急性腎功能衰竭、腎功能衰竭期、尿毒癥終末期患者；（4）尿崩癥或少尿癥患者。本研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 尿BKV DNA測定

收集所有患者的中段晨尿樣本，取10 mL中段晨尿，徹底混勻后取1.5 mL，加入Eppendorf管中，12 470×g離心10 min后取沉淀。采用裂解法提取BKV DNA。采用EPOCH紫外分光光度計（美國BioTek公司）對模板進(jìn)行總DNA定量，確保BKV DNA＞2 ng/mL（符合檢測試劑的性能要求）。采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測BKV DNA載量[8]。如檢測結(jié)果為陰性，由2名檢驗人員進(jìn)行復(fù)檢，以保證結(jié)果準(zhǔn)確。檢測儀器為ABI 7500熒光定量PCR擴增儀，試劑盒購于北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司，嚴(yán)格按試劑說明書要求進(jìn)行操作。

1.3 血FK506、尿素、Cr測定及單個核細(xì)胞計數(shù)

采集所有對象靜脈血6 mL，其中2 mL采用乙二胺四乙酸二鉀（ethylenediaminetetraacetic acid-K2，EDTA-K2）抗凝，用于FK506水平、LYMPH%、淋巴細(xì)胞絕對值（the absolute value of lymphocyte，LYMPH#）、單核細(xì)胞百分比（the percentage of monocyte，MO%）及單核細(xì)胞絕對值（the absolute value of monocyte，MO#）檢測；另4 mL采用肝素抗凝，用于尿素、Cr檢測。采用Viva-E血藥濃度監(jiān)測儀（德國西門子公司）檢測FK506水平，試劑購自珠海麗珠試劑有限公司。采用XN-1000血液分析儀（日本Sysmex公司）及配套試劑檢測LYMPH%、LYMPH#、MO%、MO#。采用cobas 8000全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑檢測尿素、Cr水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗。呈非正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗及Wilcoxon配對檢驗。計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價各項指標(biāo)判斷BKV DNA陽性的效能。正態(tài)分布數(shù)據(jù)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BKV陽性組與BKV陰性組各項指標(biāo)的比較

BKV陽性組FK506、尿素、Cr水平高于BKV陰性組（P＜0.05），2個組之間年齡、性別、LYMPH%、LYMPH#、MO%、MO#差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 BKV陽性組與BKV陰性組各項指標(biāo)的比較

2.2 血FK506、尿素、Cr與尿BKV DNA載量的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，尿BKV DNA載量與血FK506水平呈正相關(guān)（r=0.466，P＜0.001），與尿素及Cr均無相關(guān)性（r值分別為0.157、0.156，P＞0.05）。見圖1。

圖1 血FK506、尿素、Cr與尿BKV DNA的相關(guān)性

2.3 血FK506、尿素、Cr判斷尿BKV DNA陽性的效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，血FK506、尿素、Cr判斷尿BKV DNA陽性的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.685、0.581、0.606，最佳臨界值分別為7.05 ng/mL、7.20 mmol/L、100.5 μmol/L，敏感性分別為58.3%、71.4%、83.3%，特異性分別為74.3%、46.0%、38.1%。見圖2。

圖2 血FK506、尿素、Cr判斷尿BKV DNA陽性的ROC曲線

2.4 同一腎移植患者尿BKV DNA首次陰性轉(zhuǎn)陽樣時FK506、尿素和Cr水平變化

21例腎移植患者術(shù)后首次出現(xiàn)尿BKV DNA陰性轉(zhuǎn)陽性的時間為4（2～6）個月，見圖3。

圖3 腎移植患者術(shù)后首次出現(xiàn)尿BKV DNA陰性轉(zhuǎn)陽性的時間分布

與尿BKV DNA陰性時比較，同一腎移植患者首次出現(xiàn)尿BKV DNA陽性時的FK506水平明顯升高（P＜0.001），而尿素及Cr水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 同一腎移植患者尿BKV DNA首次陰性轉(zhuǎn)陽性時FK506、尿素、Cr的變化

3 討論

BKV屬于人類多瘤病毒中的一個亞型，感染后多以潛伏狀態(tài)存在，在普通人群中的隱性感染率高達(dá)80%，通常無明顯臨床癥狀。初次感染后，BKV常潛伏于腎小管上皮細(xì)胞及尿路移行上皮細(xì)胞內(nèi)，健康人并不致病。但對于腎移植術(shù)后患者，由于免疫抑制劑的使用，免疫功能被抑制而導(dǎo)致BKV再激活。BKV的高水平復(fù)制會導(dǎo)致被感染細(xì)胞出現(xiàn)松解和破壞，進(jìn)而發(fā)生組織炎性細(xì)胞浸潤，腎組織結(jié)構(gòu)被破壞，是造成腎移植失敗的重要原因之一[5]。如果能在BKV激活早期使用西多福韋、來氟米特和丙種球蛋白治療[9]，或及時調(diào)整免疫抑制劑的使用[10]，是逆轉(zhuǎn)移植腎功能喪失的關(guān)鍵，因此對BKV再激活的早期診斷尤為重要。BKV的檢測方法主要有尿液細(xì)胞學(xué)檢測、電子顯微鏡檢測、尿液病毒衣殼蛋白1 mRNA檢測、定量PCR、病理穿刺組織活檢等，這些方法各有優(yōu)缺點。血、尿BKV DNA定量檢測是目前臨床監(jiān)測BKV激活的首選方法[2]。

病毒核酸提取有異于組織及細(xì)胞，后者可通過檢測核酸總濃度或管家基因監(jiān)測擴增前的提取質(zhì)量，但針對臨床樣本病毒檢測擴增前的質(zhì)量保證，現(xiàn)階段尚無專家共識。臨床上用于尿BKV DNA檢測的樣本基本采用中段晨尿，盡量排除隨機尿中病毒濃度的不穩(wěn)定性。國產(chǎn)商品化試劑對BKV靶基因的檢測已較為成熟，具有較高的靈敏度和特異性，但針對尿BKV DNA的提取仍有一定的局限性：目前大部分試劑使用的外源性內(nèi)標(biāo)是直接加到PCR擴增體系中的，只能監(jiān)測擴增是否受抑制，而未對核酸提取過程進(jìn)行監(jiān)控；尿液的提取步驟主要是高速離心后棄上清，取沉淀裂解。澄清尿樣由于沉淀不明顯，吸取上清液時極易把沉淀中的少量細(xì)胞或病毒顆粒一并吸取掉，導(dǎo)致擴增結(jié)果出現(xiàn)假陰性。而在臨床實際工作中又無法對陰性樣本逐一復(fù)查。因此，本研究擬尋找與腎移植患者尿BKV DNA高度相關(guān)的血液檢驗指標(biāo)作為參考，當(dāng)患者尿BKV DNA為陰性，而該指標(biāo)高于對應(yīng)的陽性臨界值時，提示樣本存在假陰性的風(fēng)險較高。根據(jù)既往針對腎移植患者的研究，高水平的FK506[3，11]及LYMPH%降低[3]是促進(jìn)BKV活化的風(fēng)險因素，BKV活化患者血尿素水平高于陰性患者[5，7]，BKV血癥患者Cr水平顯著增高[5-6]。因此，本研究探討了血FK506、單個核細(xì)胞計數(shù)、尿素及Cr對腎移植患者尿BKV DNA陽性的判斷價值。

細(xì)胞免疫在腎移植患者抑制BKV激活的機制中起關(guān)鍵作用，BKV特異性T細(xì)胞是主要的功能細(xì)胞[12]。本研究結(jié)果顯示，在腎移植患者中，尿BKV DNA陽性者與BKV DNA陰性者比較，LYMPH%、LYMPH#、MO%、MO#差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。原因可能是腎移植患者一般會在BKV血癥時才表現(xiàn)出特異性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞減少[13]，而BKV在尿液中的檢出時間比在血液中的檢出時間早約1個月[2]，在尿BKV DNA陽性時，血液單個核細(xì)胞不一定出現(xiàn)明顯變化，因此對早期尿BKV再激活的判斷能力有限。范宇等[14]的研究結(jié)果顯示，腎移植患者初次發(fā)現(xiàn)BKV尿癥時，血Cr水平顯著高于基礎(chǔ)Cr值。本研究結(jié)果顯示，尿BKV DNA陽性腎移植患者血尿素及Cr水平雖然稍高于尿BKV DNA陰性腎移植患者，但尿素及Cr判斷尿BKV DNA陽性的AUC分別僅為0.581及0.606，且與尿BKV DNA載量無相關(guān)性。腎移植患者首次出現(xiàn)尿BKV DNA由陰性轉(zhuǎn)陽性時，血尿素及Cr水平的變化并不明顯。原因可能是BKV造成的腎功能損傷是一個持續(xù)、緩慢的過程，通常只有當(dāng)患者出現(xiàn)BKV尿癥（尿BKV DNA＞1.0×107拷貝/mL），甚至發(fā)展成BKV血癥時，才出現(xiàn)腎功能急劇衰退[12]。因此，血尿素及Cr對判斷腎移植患者尿BKV DNA陽性的價值較低。

目前，臨床最常用的腎移植后免疫抑制方案是以鈣調(diào)磷酸酶抑制劑為主的三聯(lián)免疫抑制方案，即FK506或環(huán)孢素A+霉酚酸酯或麥考酚鈉+激素，其中環(huán)孢素A對BKV有一定的抑制作用[15]，有利于降低BKV活化的風(fēng)險[16]，霉酚酸酯或麥考酚鈉與BKV活化無明顯相關(guān)性[11]。FK506作為主流免疫抑制劑，目前被普遍認(rèn)為是增加BKV活化風(fēng)險的獨立危險因素。血FK506水平的降低有利于BKV血癥的消退，且能明顯改善早期無急性排斥或移植腎功能喪失的BKV相關(guān)腎病患者的預(yù)后[3-4]。體外研究結(jié)果顯示，F(xiàn)K506可通過腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的FK506結(jié)合蛋白12促進(jìn)BKV的活化與復(fù)制[15，17]。本研究結(jié)果顯示，腎移植患者尿BKV DNA載量與血FK506水平呈正相關(guān)（r=0.466，P＜0.001），與文獻(xiàn)報道[11]相符。另外，腎移植患者血FK506水平在首次出現(xiàn)尿BKV DNA陽性時明顯增高，本研究ROC曲線分析結(jié)果提示，當(dāng)腎移植患者血FK506＞7.05 ng/mL時，尿BKV DNA陽性的可能性較大，若此時該份樣本尿BKV DNA呈陰性，再次收集樣本進(jìn)行復(fù)查，或許有助于減少尿BKV DNA假陰性的發(fā)生。

綜上所述，F(xiàn)K506在判斷腎移植患者尿BKV DNA陽性中有一定價值。由于FK506個體藥物代謝差異較大，因此本研究單純以血FK506水平作為參考有一定局限性，這也可能是其AUC未達(dá)理想水平的原因。對此，有學(xué)者提出以個體代謝率（血藥濃度/日給予量）評估FK506對BKV活化的風(fēng)險可能更為合理[18]。另外，由于本研究用于配對比較的例數(shù)僅為21例，樣本量較小，因此后續(xù)將繼續(xù)擴大樣本量，并通過隨訪搜集更完整的臨床資料，進(jìn)一步完善本研究的結(jié)論。