不同滅活條件對常見呼吸道病原體核酸檢測結果的影響

王博文， 曾曉華， 彭凱歌， 劉 暢， 武瑩超， 黃英眉，馬盼盼， 拉姆次仁， 李國凱，楊 莉

（1.西藏軍區(qū)疾病預防控制中心，西藏 拉薩 850000；2.西藏軍區(qū)總醫(yī)院感染科，西藏 拉薩 850000）

呼吸道感染是臨床最常見的感染性疾病之一，發(fā)病率和病死率常年居高不下[1]。西藏地區(qū)海拔高、氣壓低、氧氣稀薄、氣溫變化快，極易引起機體免疫力下降，呼吸道感染的發(fā)病率更高，患者病情更重、病程更長[2]。目前，臨床上普遍采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測患者鼻拭子和咽拭子樣本中的呼吸道病原體，該方法具有通量高，敏感性和特異性好的特點，對呼吸道感染的病原學診斷具有重要意義[3]。

2019年年底以來，由于嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiatory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）檢測生物安全防護的需要，鼻拭子和咽拭子樣本在進行核酸檢測前需要56 ℃熱處理30 min，以達到病毒滅活的目的[4-5]。但在實際操作過程中，受檢測單位條件和檢測人員操作的限制，滅活溫度會有所波動，滅活時間也時常延長。不同滅活條件對樣本呼吸道病原體核酸檢測結果是否會產(chǎn)生影響，目前鮮見報道。本研究收集了12例腺病毒、支原體、甲型流感病毒或乙型流感病毒檢測陽性患者的鼻拭子和咽拭子樣本，設計不同的滅活條件，對比滅活前后qPCR的檢測結果，為確保呼吸道病原核酸檢測結果的準確性提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2020年1月—2021年3月就診于西藏軍區(qū)總醫(yī)院腺病毒、支原體、甲型流感病毒或乙型流感病毒核酸檢測陽性患者的鼻拭子和咽拭子樣本各3份，共計12份。

1.2 儀器與試劑

TaKaRaMiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit[寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司]，腺病毒、支原體、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸檢測試劑盒（北京金豪制藥股份有限公司），病毒采樣管（北京友康生物公司），Rotor Gene Q實時熒光定量PCR儀（德國Qiagen公司），恒溫水槽（常州澳華儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 （1）咽拭子樣本。用聚丙烯纖維頭塑料桿拭子擦拭患者雙側咽扁桃體及咽后壁，然后將拭子頭浸入病毒采樣管的采樣液中，尾部棄去，旋緊采樣管螺旋口。（2）鼻拭子樣本。將聚丙烯纖維頭塑料桿拭子輕輕插入患者鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動退出，然后將拭子頭浸入同一病毒采樣管的采樣液中，棄去尾部，旋緊采樣管螺旋口。

1.3.2 樣本滅活溫度梯度和時間梯度設置 將鼻拭子和咽拭子樣本置于恒溫水槽中，分別于56、66、76和86 ℃熱處理30 min；于56 ℃分別處理30、60、120、240、480和960 min。處理完畢后進行樣本核酸提取。

1.3.3 核酸提取和病原體檢測 采用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit提取核酸，按照說明書要求進行操作，每個樣本提取需要200 μL采樣液。采用腺病毒、支原體、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸檢測試劑盒在Rotor Gene Q實時熒光定量PCR儀上進行qPCR檢測，按照說明書要求進行操作，陽性判讀標準參考各試劑盒說明書，所有檢測均重復3次，取平均循環(huán)閾值（cycling threshold，Ct）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，每組樣本的Ct值用±s表示。未滅活和不同滅活條件處理樣本之間Ct值的比較采用Dunnett-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者基本信息

患者的性別、年齡、病原學診斷、核酸類型和Ct值見表1。

表1 患者基本信息

2.2 不同滅活溫度對樣本qPCR檢測結果的影響

對于腺病毒和支原體，56 ℃和66 ℃滅活3 0 m i n 與未滅活相比，C t 值無明顯變化（P＞0.05），76 ℃和86 ℃滅活30 min可引起樣本Ct值顯著升高（P＜0.05、P＜0.01）；甲型流感病毒和乙型流感病毒，56 ℃滅活30 min與未滅活相比，Ct值無明顯改變（P＞0.05），66 ℃、76 ℃和86 ℃滅活30 min會導致樣本Ct值升高（P＜0.05、P＜0.01）。見圖1。

圖1 不同滅活溫度對樣本qPCR檢測結果的影響

2.3 不同滅活時間對樣本qPCR檢測結果的影響

對于腺病毒和支原體，56 ℃滅活30、60、120和240 min與未滅活相比，Ct值無明顯變化（P＞0.05）；滅活480和960 min可引起樣本Ct值顯著上升（P＜0.01、P＜0.001）。對于甲型流感病毒和乙型流感病毒，56 ℃滅活30、60和120 min與未滅活相比，Ct值無明顯改變（P＞0.05）；滅活240、480和960 min會導致樣本Ct值增大（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。見圖2。

圖2 不同滅活時間對樣本qPCR檢測結果的影響

3 討論

西藏自治區(qū)平均海拔超過4 000 m，年平均氣溫8 ℃，氧含量低，對人體免疫系統(tǒng)損傷大，極易引起呼吸道感染[6-7]。80%以上的高原呼吸道疾病是由非細菌性病原體引起的，其中腺病毒、肺炎支原體、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒最為常見[8]。qPCR檢測已成為呼吸道病原學診斷的主流方法，該方法簡便易行、靈敏度高、特異性強。隨著新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情的出現(xiàn)，為了最大程度保護實驗室人員，COVID-19診療方案明確指出，SARS-CoV-2樣本檢測前一定要經(jīng)過滅活處理，推薦滅活方式為56 ℃熱處理30 min[9]。然而不同的病原體對熱滅活的敏感性相差很大：對于嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒，56 ℃熱處理30 min可以使其核酸降解，并低于檢測限[10]；而SARS-CoV-2 56 ℃熱處理30 min只能將病毒滅活，不會影響核酸檢測結果[11]；同樣，該滅活操作將會導致豬流行性腹瀉病毒——冠狀病毒RNA的明顯降解[12]。但是目前尚未見熱滅活處理對常見呼吸道病原體檢測結果的影響的相關研究。此外，西藏自治區(qū)檢測單位條件相對落后，一些實驗室樣本加熱設備溫控系統(tǒng)不穩(wěn)定，實際溫度可能比預設溫度高幾十度；一些實驗人員操作不規(guī)范，隨意延長樣本滅活時間，甚至過夜滅活。這些問題都可能對實驗結果造成巨大影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，DNA病原體和RNA病原體對熱的敏感性不盡相同，相同滅活時長，腺病毒和支原體核酸可以抵御66 ℃熱滅活，而甲型流感病毒和乙型流感病毒在66 ℃就會出現(xiàn)不同程度的核酸降解；同樣的滅活溫度下，腺病毒和支原體核酸可以承受240 min加熱，而甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸只能在120 min內(nèi)維持穩(wěn)定；這可能是不同核酸類型結構穩(wěn)定性不同決定的[13]。尤其是對于核酸含量較低的弱陽性樣本，提高滅活溫度和延長滅活時間可能會造成樣本Ct值的明顯變化，甚至可能導致樣本核酸檢測假陽性結果。本研究未收集到病毒載量很低的弱陽性樣本，沒有展示出滅活條件改變對弱陽性樣本檢測結果的影響，我們會在下一步研究中進行深入探討。

綜上所述，為保證qPCR檢測的敏感性，避免呼吸道病原體的漏檢、誤檢，建議對于鼻拭子和咽拭子樣本進行滅活處理時，溫度應控制在56 ℃左右，滅活時間應控制在120 min以內(nèi)。各臨床實驗室應結合自身實際情況，盡可能優(yōu)化操作步驟，嚴格操作流程，確保檢測過程安全、規(guī)范，檢測結果穩(wěn)定、可靠。