青牛膽莖節(jié)組織培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)研究

張瀟月，溫朝平，周 宇，董凱密，陳 華，王仁睿，侯大斌，楊玉霞，余 馬

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥材品質(zhì)及創(chuàng)新中藥研究四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041）

青牛膽（Tinospora sagittata）為防己科青牛膽屬草質(zhì)藤本植物，主要分布于湖北西部和西南部、陜西南部、四川東部至西南部、西藏東南部、湖南、江西等地［1］，其塊根名為金果欖，是常用中藥，含有生物堿、萜類、甾醇類等活性成分［2］，主要用于治療咽喉腫痛、癰疽疔毒、痢疾等疾病［3］。由于國家對中醫(yī)藥行業(yè)的大力支持，市場對金果欖的需求量急劇增加，使得青牛膽野生資源被無序采挖，趨于短缺。為了解決這一問題，人工栽培青牛膽是實(shí)現(xiàn)該藥材可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。

組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖系數(shù)高、品種遺傳穩(wěn)定性高、不受季節(jié)和自然條件限制等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)種苗的大批量生產(chǎn)［4］。目前針對青牛膽的組織培養(yǎng)報(bào)道較少，劉艷等［5］建立了青牛膽的組培快繁體系，確定了消毒時(shí)間、嫩莖和嫩葉愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基、腋芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。本課題組以劉艷等［5］報(bào)道的快繁體系為參考，建立青牛膽的組織快繁體系，前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)莖段不同節(jié)間的出芽率存在較大差異，且在繼代培養(yǎng)時(shí)存在叢生芽長勢較弱、葉色較淺的情況。因此，本研究以青牛膽莖段為材料，篩選腋芽最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，研究不同節(jié)間對腋芽誘導(dǎo)的影響及不同培養(yǎng)基對壯苗的作用，以期為青牛膽的規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支持，對青牛膽優(yōu)質(zhì)種苗的工廠化生產(chǎn)具有重要的實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

青牛膽采自四川峨眉山，引種于西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院龍山實(shí)驗(yàn)基地溫室中栽培，選取青牛膽生長狀態(tài)一致的莖段為材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒 將青牛膽枝條根據(jù)莖節(jié)所在部位不同進(jìn)行編號，頂端的莖段標(biāo)記為①號，以下的帶芽莖節(jié)依次標(biāo)記為②～⑥（圖1a）。將莖段分別剪成1.0～1.5 cm長帶1個(gè)節(jié)的莖段（圖1b），按照不同編號進(jìn)行收集。去除葉片，用飽和洗衣粉溶液浸泡10min，流水沖凈，75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗2次，0.1%升汞溶液+1～2滴吐溫-20振蕩消毒7 min，無菌水沖洗4次，無菌濾紙吸干多余的水分備用。

1.2.2 莖段不同節(jié)間的腋芽誘導(dǎo) 切去莖段兩端與升汞溶液接觸的部分，將莖段依次接種于MS+0.2mg/L 6-BA+0.5 mg/LKT+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3啟動培養(yǎng)基［5］培養(yǎng)4周。培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，pH為5.8，培養(yǎng)溫度為（24±2）℃，光照強(qiáng)度為1 800 lx，光照時(shí)間為12 h/d。

1.2.3 增殖培養(yǎng) 將誘導(dǎo)出的腋芽（＞0.5 cm）切下，接種于新鮮的MS+0.2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.2mg/L NAA+0.5 mg/L GA3培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)4周，培養(yǎng)環(huán)境同上。

1.2.4 壯苗試驗(yàn) 將增殖后較弱的叢生芽分成單株，挑選高度一致的苗接種于MS和MS+10 mL/L乙二胺四乙酸鐵鈉（EDTA-Fe）2種培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)4周，培養(yǎng)環(huán)境同上。

1.2.5 生根培養(yǎng) 將壯苗后的植株轉(zhuǎn)至1/2 MS+0.5mg/L IBA+0.5 mg/L NAA［5］進(jìn)行生根培養(yǎng)6周，培養(yǎng)環(huán)境同上。

1.2.6 移栽煉苗 待生根完成后，逐漸打開瓶口，使生根苗逐漸適應(yīng)外界環(huán)境，煉苗1周后，取出小苗，洗凈根部的培養(yǎng)基，用0.5%多菌靈溶液浸泡小苗根部10 min，清洗晾干后，移至滅過菌的珍珠巖+園土（1∶1）基質(zhì)中培養(yǎng)，相對濕度70%～80%，加強(qiáng)通風(fēng)，1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)調(diào)查

每個(gè)處理接種10個(gè)外植體，重復(fù)3次，莖段不同節(jié)間的腋芽誘導(dǎo)試驗(yàn)于培養(yǎng)4周時(shí)統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率和＞0.5 cm的腋芽數(shù)量，壯苗試驗(yàn)培養(yǎng)4周時(shí)統(tǒng)計(jì)平均株高和葉色情況。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

誘導(dǎo)率=（萌芽的外植體數(shù)量/接種外植體總數(shù)）×100%。

褐化率=（褐化的外植體數(shù)量/接種外植體總數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖段不同節(jié)間對腋芽誘導(dǎo)的影響

在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后可觀察到腋芽開始萌動（圖1c），培養(yǎng)4周后莖段不同節(jié)間在同一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上對腋芽的誘導(dǎo)情況存在很大差異，隨著①號莖節(jié)至⑦號莖節(jié)位置的變化，腋芽的誘導(dǎo)率和＞0.5 cm的腋芽數(shù)量逐漸降低，褐化率逐漸增高。①號莖節(jié)的誘導(dǎo)率為93.3%，顯著高于其他部位，褐化率為13.3%，＞0.5 cm的腋芽數(shù)量為6.7個(gè)，除了與②號莖節(jié)的褐化率和腋芽數(shù)量差異不顯著外，顯著優(yōu)于其他部位。⑥和⑦號莖節(jié)的誘導(dǎo)率分別為26.7%和20.0%，顯著低于其他部位，褐化率達(dá)50.0%、63.3%，＞0.5 cm的腋芽數(shù)量分別為2.3、2.0個(gè)（表1）。

表1 不同莖節(jié)對腋芽的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對壯苗效果的影響

鐵鹽對青牛膽組培苗的壯苗效果起著關(guān)鍵作用，在壯苗培養(yǎng)基里生長4周后，生長在MS+10 mL/L EDTA培養(yǎng)基的組培苗平均苗高為4.1 cm（圖2），平均葉片數(shù)量為6.5片，葉色濃綠（圖1d）。生長在MS培養(yǎng)基的組培苗平均苗高和平均葉片數(shù)量均顯著低于前者，分別為2.8 cm和3.3片，葉色較淡（圖1d）。

圖2 不同壯苗培養(yǎng)基對平均苗高和葉片數(shù)量的影響

3 討論

目前青牛膽的組織培養(yǎng)相關(guān)研究很少，已報(bào)道的青牛膽［5］和青牛膽屬部分植物如寬筋藤［6］、心葉青牛膽［7］建立的快繁體系并未研究不同莖節(jié)對腋芽誘導(dǎo)的影響。本研究在劉艷等［5］建立的組培快繁體系基礎(chǔ)上，著重研究不同莖節(jié)對腋芽誘導(dǎo)的差異，并證明培養(yǎng)基中添加10 mL/L的EDTA-Fe是有效的壯苗方式，解決了青牛膽增殖叢生芽孱弱的問題，有效地提高了種苗的質(zhì)量。①號莖節(jié)的誘導(dǎo)率和＞0.5 cm的腋芽數(shù)量分別達(dá)93.3%和6.7個(gè)，顯著高于其他莖節(jié)，隨著莖節(jié)位置的變化，誘導(dǎo)率和＞0.5 cm腋芽數(shù)量顯著降低，褐化率升高，證明莖節(jié)的幼嫩程度對腋芽誘導(dǎo)的影響較大，木質(zhì)化程度越高的莖節(jié)越容易褐化。在實(shí)際生產(chǎn)中，為了增大外植體的數(shù)量，并保證較高的誘導(dǎo)率，可以使用①～⑤號莖節(jié)作為外植體，平均誘導(dǎo)率為67.3%，平均褐化率為32.7%，＞0.5 cm的平均腋芽數(shù)量為4.5個(gè)。⑥、⑦號莖節(jié)木質(zhì)化程度高，平均誘導(dǎo)率為23.4%，平均褐化率達(dá)56.7%，不適合選作外植體。

莖節(jié)作為外植體進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)已在多種藥用植物上有所應(yīng)用，如燈油藤（Celastrus paniculatus）［8］、白花莧（Aerva sanguinolenta）［9］、穿心蓮（Andrographis paniculata）［10］、短蕊萬壽竹（Disporum cantoniense）［11］、公石松［12］等。據(jù)研究，不同位置的莖節(jié)對腋芽誘導(dǎo)的效率不同。Gitonga等［13］報(bào)道澳洲堅(jiān)果靠近頂端的1～3號莖節(jié)對腋芽的誘導(dǎo)效果優(yōu)于靠近基部的4～6節(jié)；Shirdel等［14］報(bào)道玫瑰基部莖節(jié)的腋芽萌發(fā)率最高，為30%，腋芽長度為5.75 cm，中間莖節(jié)的腋芽萌發(fā)率最低，為17.4%，腋芽長度為2.8 cm。以上研究說明不同植物不同位置的莖節(jié)對腋芽的誘導(dǎo)情況不同。劉艷等［5］報(bào)道的青牛膽腋芽誘導(dǎo)率為45%，應(yīng)是多個(gè)位置的節(jié)間混合而得的平均誘導(dǎo)率。本研究結(jié)果表明，①號莖節(jié)腋芽誘導(dǎo)率最高，隨著位置向下變化，腋芽誘導(dǎo)率逐漸降低，由此可見，篩選節(jié)間位置可有目的地進(jìn)行取樣，并有效提高腋芽誘導(dǎo)率。

褐化容易造成植物死亡，是組織培養(yǎng)過程中一個(gè)重要的問題，這主要與植物體酚類化合物的含量有關(guān)，當(dāng)植物體表面形成傷口，酚類化合物氧化，形成黑色或褐色螯合物，導(dǎo)致植物部分變暗［15，16］。不同位置的莖節(jié)在組織培養(yǎng)過程中褐化程度不同，這是因?yàn)槎喾宇惢衔镌谀举|(zhì)化程度高的組織中合成較多，在木質(zhì)化程度低的幼嫩組織中合成較少［17］。石榴頂端莖節(jié)（1.5 cm）在組培過程中褐化程度最輕，基部莖節(jié)褐化程度最重［18］，這與本研究結(jié)果一致，青牛膽①、②號莖節(jié)的褐化率為20%以下，③～⑦號莖節(jié)的褐化率增至40%以上。由此可見，在外植體的選擇上，選擇幼嫩、褐化程度較輕的莖節(jié)可極大地降低褐化率，提高成活率。

植物種苗經(jīng)增殖階段后，容易出現(xiàn)叢生芽孱弱的現(xiàn)象，影響生根和后期移栽效果，為了使種苗健壯，需要在增殖之后進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。據(jù)報(bào)道，在壯苗培養(yǎng)階段，在培養(yǎng)基中添加一些物質(zhì)如GA3［19］、VB1［20］、蛋白胨［20，21］、水解酪蛋白［22］等，可有效提高種苗的生長勢，另有研究表明種苗在含高濃度的細(xì)胞分裂素上生長后適當(dāng)降低或去除細(xì)胞分裂素，對壯苗有一定的促進(jìn)作用［4］。常立國等［23］將馬鈴薯弱苗放置于不含激素的3MS上生長，壯苗效果最佳，莖稈粗壯、葉片多、葉面積大。本研究使用了不添加激素的MS培養(yǎng)基和MS+EDTA-Fe 2種培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基對壯苗有一定的效果，但MS+EDTA-Fe培養(yǎng)基壯苗效果更優(yōu)。于艷等［24］在建立多年生麻櫟組培體系過程中，初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中均使用2倍鐵鹽，有效提高了多年生麻櫟莖段的不定芽誘導(dǎo)率和再生植株成活率；Papathanasiou等［25］報(bào)道將培養(yǎng)基中的可溶性鐵濃度降低后，馬鈴薯種苗在隨后的培養(yǎng)中出現(xiàn)枯黃的現(xiàn)象，這些報(bào)道均說明了鐵鹽對于組培苗尤其是葉片生長具有重要的促進(jìn)作用。本研究在MS培養(yǎng)基中另外增加了10 mL/L EDTA-Fe后，種苗生長健壯，葉色濃綠，證明該濃度的鐵鹽適合青牛膽種苗生長。

研究了不同節(jié)間對腋芽誘導(dǎo)的影響，確定了適合用作外植體的具體節(jié)間位置，并篩選了壯苗培養(yǎng)基，該組織培養(yǎng)體系可為青牛膽的工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)指導(dǎo)。