羅漢果多糖的羧甲基化修飾及抗氧化性能影響研究

白家峰，姚延超，鄭 毅，劉紹華，劉啟斌，周 奕，邢雨晴，楊雯靜，許春平

（1.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，南寧 530001；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450002；3.廣西真龍實業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，廣西 賀州 542600）

羅漢果（Siraitia grosvenorii）是中國特有的多年生葫蘆科攀援植物，含有豐富的維生素C、葡萄糖等人體所需功能成分，被衛(wèi)生部認(rèn)證為藥食兩用的中藥材，有止咳、潤喉的作用，又被譽為“神仙果”［1］。目前對羅漢果多糖的研究主要集中在抗氧化、降血糖、抗腫瘤活性以及藥理方面的研究［2-7］，但是對羅漢果多糖進行羧甲基化修飾以及羧甲基化產(chǎn)物的抗氧化性能的研究較少。

自由基是一類非?；钴S的化學(xué)物質(zhì)，是帶有不成對（奇數(shù)）電子的原子、原子團、分子和離子。人體內(nèi)自由基的增多會導(dǎo)致免疫功能出現(xiàn)障礙，長時間可引發(fā)炎癥并加劇衰老［8］。Chen等［9］采用熱水浸提法制備苦瓜多糖，并制備羧甲基化苦瓜多糖（CMP），通過對苦瓜多糖和羧甲基化苦瓜多糖的抗氧化性測試，證明羧甲基化修飾能明顯地提高苦瓜多糖的抗氧化性。趙鵬等［10］通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化了羧甲基化倒卵葉五加多糖的合成工藝，優(yōu)化工藝后得到的羧甲基化倒卵葉五加多糖相比于倒卵葉五加多糖抗氧化活性有了明顯地改善。

本研究選取廣西的羅漢果為研究對象，通過酶解法提取羅漢果多糖，并對提取的羅漢果多糖進行羧甲基化修飾，同時研究其清除自由基的能力，為今后羅漢果多糖在保健食品中的應(yīng)用與開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料與儀器

材料：羅漢果（產(chǎn)自廣西）。

試劑：乙酸乙酯、氫氧化鈉、甲醇、水楊酸、冰乙酸、正丁醇、異丙醇、丙二醇吡啶、氯仿、三氟乙酸、纖維素酶、果膠酶、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、30%過氧化氫均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：SCIENTZ-10N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；DGX-9143電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；永磁直流電動攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；Nicolet5700型傅里葉變換紅外光譜儀，F(xiàn)ourier transformInfrared spectrometer FTIR，美國布魯克海文儀器公司；UV-17001C紫外分光光度計，上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司。

1.2 方法

1.2.1 羅漢果多糖的提取 使用酶解法提取羅漢果多糖［11］。將羅漢果干燥并粉碎，乙酸乙酯加熱回流脫脂2 h。烘干后稱取脫脂羅漢果粗粉200 g，加入4 000 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液浸提3 h。靜置后，收集沉淀。加入4 000 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%纖維素酶和0.25%果膠酶的水溶液浸提12 h，離心（4 000 r/min，15 min），收集上清液，加入Sevage試劑（V氯仿∶V正丁醇=4∶1）脫蛋白［12，13］，攪拌0.5 h，離心后收集上清液，重復(fù)操作3次。分離出上清液，使用過氧化氫除去色素。將所得上清液在60℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮后加入3倍上清液體積的無水乙醇，沉降2 h，離心取沉淀，加水至溶解。將所得溶液進行濃縮，冷凍干燥得到精制羅漢果多糖。

1.2.2 羧甲基化修飾 使用李霞等［14］的方法并加以改進，取羅漢果多糖200 mg，溶于25 mL異丙醇，攪拌下加入20%氫氧化鈉10 mL堿化處理3 h。將2.63 g氯乙酸溶于25 mL的異丙醇，再加入20%氫氧化鈉溶液10 mL，充分?jǐn)嚢?，緩慢滴加一半混合液于反?yīng)液中，攪拌3 h。升溫至60℃反應(yīng)30 min。滴加另一半混合液于反應(yīng)液中，在60℃下反應(yīng)1 h。用0.5 mol/L CH3COOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液至pH 7。透析5 d，濃縮至10 mL，冷凍干燥得到羧甲基化的羅漢果多糖。

1.2.3 羧甲基化取代度的測定 精確稱取10 mg羧甲基化羅漢果多糖樣品，放入烘箱中干燥1～2 h，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇3 mL，混合后放置5 min。依次加入10 mL蒸餾水，50 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液，混合攪拌至多糖樣品溶解。然后用0.1 mol/L的HCl滴定，以酚酞為指示劑，至紅色褪去，計算每克羧甲基多糖所需HCl的用量A［15］。

式中，V0代表加入的NaOH的體積，mL；V2代表測定消耗的HCl的體積，mL；V1代表空白測定所消耗HCl的體積；M0代表加入的NaOH濃度；M代表HCl的濃度；W為樣品的質(zhì)量，g。羧甲基取代度（DS）計算公式如下。

1.2.4 單糖組成分析 稱取20 mg羅漢果多糖，溶于15 mL 2 mol/L的三氟乙酸，121℃油浴水解。將所得溶液旋干，然后加入2 mL甲醇，再次蒸干，重復(fù)3次。加入2 mL吡啶，0.2 mL衍生試劑BSTFA∶TMCS（99∶1），80℃加熱4 h。過0.45 mm濾膜，利用GC-MS法檢測各單糖成分。

色譜條件：HP-5MS型彈性石英毛細(xì)管柱（30.0 m×250μm×0.25μm）；載氣氦氣；流速1 mL/min，溶劑延遲10 min；進樣方式為分流比5∶1；進樣口溫度250℃，進樣量1μL。程序升溫為初始溫度50℃，保持2 min，然后以4℃/min的速率升至240℃，并保持5 min。

質(zhì)譜條件：EI源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，質(zhì)量掃描范圍30～550 AMU，傳輸線溫度240℃，對采集到的質(zhì)譜圖用NIST11譜庫進行檢索。比較標(biāo)準(zhǔn)單糖與樣品保留時間，確定單糖組成。

1.2.5 紅外光譜分析 稱取2～3 mg精制羅漢果多糖和羧甲基化羅漢果多糖，加入KBr粉末，磨細(xì)之后壓片，使用傅立葉變換紅外光譜儀，在4 000～400cm-1內(nèi)掃描紅外吸收值。

1.2.6 SEC/MALLS/RI分析 體積色譜（SEC）—示差檢測（RI）—多角度激光光散射（MALLS）聯(lián)用技術(shù)兼具了色譜法和光散射法的特點，光散射儀可從多個不同角度對散射光進行檢測，同時能快速、準(zhǔn)確地測定出高分子的重均分子量（Mw）、數(shù)均分子量（Mn）、粘分子量、分子量分布等，而且準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性很好［16］。稱取20 mg羅漢果多糖加入到5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液，80℃攪拌至完全溶解。流動相為0.2%NaNO3和0.02%NaN3，測試溫度25℃，進樣量100μL，流速為0.4 mL/min。用Astra軟件進行數(shù)據(jù)采集和分析。

1.2.7 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率測定 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）是在含有自由基的化學(xué)反應(yīng)中作為一種監(jiān)測反應(yīng)的物質(zhì)，常用于抗氧化成分的體外抗氧化性評價。分別配置濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/L的多糖母液于具塞試管中。設(shè)置5個測試組，2兩個樣品組分別對應(yīng)羅漢果多糖和羧甲基化多糖，1個對照組和2個空白組來避免樣品本身吸光度的影響。樣品組為3.5 mL 0.1 g/L的DPPH的50%乙醇溶液+0.5 mL樣品溶液；對照組為3.5 mL 0.1 g/L的DPPH的50%乙醇溶液+0.5 mL蒸餾水；空白組為3.5 mL無水乙醇+0.5 mL樣品溶液。將不同質(zhì)量濃度的多糖樣品對應(yīng)的3組溶液分別加入10 mL具塞試管中，充分混勻，避光靜置30 min，在517 nm波長處測定吸光度，依次標(biāo)記為A2、A0、A1。計算羅漢果多糖及其羧甲基化羅漢果多糖對DPPH·的清除率E［17］。

式中，A0為對照組吸光度；A1為空白組吸光度；A2為樣品組吸光度。

1.2.8 羥基自由基清除率的測定 分別配置質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的羅漢果多糖溶液和羧甲基化羅漢果多糖溶液于具塞試管中，設(shè)置5個測試組，2個樣品組分別對應(yīng)羅漢果多糖和羧甲基化多糖，1個空白組，2個對照組來避免樣品本身吸光度的影響。樣品組為樣品溶液1 mL依次加入9 mmol/L FeSO4溶液1 mL、9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL、8.8 mmol/L的H2O2溶液1 mL，充分混勻后37℃水浴30 min［18］；空白組則為用蒸餾水代替樣品溶液再分別加入FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液和H2O2溶液，對照組則為1 mL樣品溶液加入3 mL無水乙醇溶液，計算對羥基自由基的清除率，計算公式如下。

式中，A1為樣品組吸光度；A0為空白組吸光度；A2為對照組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 SEC/MALLS/RI分析結(jié)果

體積色譜（SEC）—示差檢測（RI）—多角度激光光散射（MALLS）串聯(lián)是檢測生物大分子分子量最有效、最簡便的方法之一，適用于檢測多糖等大分子結(jié)構(gòu)。本試驗采用靜態(tài)光散射得到羅漢果多糖在氯化鈉溶液中的重均分子量Mw為5.369×104g/mol，數(shù)均分子量Mn為3.597×104g/mol，均方根旋轉(zhuǎn)半徑Rw為25.2 nm，多分散系數(shù)Mw/Mn用于說明聚合物的寬度（如多糖）分子量分布，Mw/Mn的值越大，分子量分布越寬。羅漢果多糖的多分散系數(shù)為1.493，說明提取出來的羅漢果多糖在水溶液中容易聚集，溶解度較小。

2.2 紅外光譜分析結(jié)果

羅漢果多糖的紅外光譜見圖1，說明羅漢果多糖具有多糖類的紅外特征吸收峰，3 267 cm-1為O-H的伸縮振動吸收峰，2 917 cm-1為C-H的伸縮振動吸收峰，1 591 cm-1為C-O伸縮振動吸收峰，1 412 cm-1為C-H彎曲振動吸峰，1 014 cm-1為糖環(huán)醚鍵C-OC的不對稱伸縮振動吸收峰，構(gòu)成了糖類特征吸收峰。

圖1 羅漢果多糖和羧甲基化羅漢果多糖的紅外光譜

羧甲基化羅漢果多糖的紅外光譜見圖1，3 304 cm-1為O-H的伸縮振動吸收峰，2 945 cm-1為C-H的伸縮振動吸收峰，1 100 cm-1為糖環(huán)中C-O-C的伸縮振動吸收峰，說明羧甲基化羅漢果多糖具有多糖類物質(zhì)的特征吸收峰，對比羧甲基羅漢果多糖與羅漢果多糖的紅外光譜可發(fā)現(xiàn)，羧甲基羅漢果多糖1 402 cm-1和1 602 cm-1處分別出現(xiàn)羧酸鹽的對稱伸縮振動吸收與反對稱振動吸收峰。由此表明，反應(yīng)實現(xiàn)了羅漢果多糖的羧甲基化修飾［19］。

2.3 單糖組成分析結(jié)果

通過酶解法提取多糖，提取率為3.64%，并使用氧化鈉-氯乙酸法對羅漢果多糖進行了羧甲基化修飾，羧甲基化取代度為0.41。羅漢果多糖衍生化產(chǎn)物的總離子流見圖2，與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比，羅漢果多糖主要由呋喃糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖等6種中性糖以及半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等酸性成分組成，結(jié)合面積歸一法分析可得羅漢果多糖的單糖組分如表1所示。

圖2 羅漢果多糖衍生化產(chǎn)物總離子流

表1 羅漢果多糖單糖組成

2.4 DPPH自由基清除活性

羅漢果多糖及其羧甲基化產(chǎn)物清除DPPH結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，羅漢果多糖及其羧甲基化產(chǎn)物都具有清除DPPH的活性，在0～7 mg/mL內(nèi)羅漢果多糖及其羧甲基化產(chǎn)物的DPPH清除率隨濃度提高而快速增加，羧甲基化羅漢果多糖的DPPH清除率大于羅漢果多糖。在濃度為5 mg/mL時，通過計算得到羅漢果多糖和羧甲基化羅漢果多糖的P為0.002 36，為極顯著；當(dāng)濃度為10 mg/mL時P為0.041，小于0.05。羧甲基化羅漢果多糖DPPH清除能力相較于羅漢果多糖有顯著提高。

圖3 羅漢果多糖及羧甲基化羅漢果多糖清除DPPH測定結(jié)果

2.5 羥基自由基（·OH）清除活性

羅漢果多糖及其羧甲基化產(chǎn)物對羥基自由基（·OH）的清除作用如圖4所示。由圖4可知，羅漢果多糖及其羧甲基化產(chǎn)物均對Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基有清除作用，且隨濃度的增加清除率逐漸升高。在濃度達到1.0 mg/mL時，羧甲基化羅漢果多糖對羥基自由基的清除率達到33.68%，羅漢果多糖的清除率達到31.33%，經(jīng)過計算可知P為0.036，小于0.05。羧甲基化羅漢果多糖清除羥基自由基能力相對于羅漢果多糖有顯著提高。在低濃度范圍內(nèi)，羧甲基化羅漢果多糖表現(xiàn)出較強的清除活性。

圖4 羅漢果多糖及羧甲基化羅漢果多糖清除羥基自由基測定結(jié)果

3 結(jié)論

采用酶解法提取羅漢果多糖，多糖提取率3.64%，并使用氧化鈉-氯乙酸法對羅漢果多糖進行了羧甲基化修飾，羧甲基化取代度為0.41。使用GC/MS技術(shù)分析羅漢果多糖單糖組分，發(fā)現(xiàn)羅漢果多糖主要由呋喃糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖等6種中性糖以及半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等酸性成分組成。紅外光譜表征顯示，羅漢果多糖已成功進行羧甲基化修飾。通過SEC/MALLS/RI分析得到羅漢果多糖的重均分子量Mw為5.369×104g/mol，數(shù)均分子量Mn為3.597×104g/mol，均方根旋轉(zhuǎn)半徑Rw為25.2 nm，多分散系數(shù)Mw/Mn為1.493。

通過DPPH清除測定和羥基自由基清除測定，在相同質(zhì)量濃度下羧甲基化羅漢果多糖抗氧化活性比羅漢果多糖要強，多糖在羧甲基化過程中會產(chǎn)生一些多糖的衍生物，這些衍生物的抗氧化基團更容易與自由基結(jié)合，從而產(chǎn)生更好的清除效果，另外多糖在羧甲基化過程中還會產(chǎn)生三股螺旋結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)無規(guī)則線團分布，已經(jīng)有文獻證明無規(guī)則線團分布的抗氧化性強于其他組分［20］?？梢婔燃谆揎椖軌蚋淖兞_漢果多糖的生物活性，提高羅漢果多糖的抗氧化性能，為羅漢果多糖和羧甲基化羅漢果多糖在食品保健中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。