HPLC-ESI-MS/MS法同時測定血必凈注射液中11種有效成分的含量*

王 紅，劉 玲，蘇聯(lián)麟，郭志花，崔永偉**

1 南京市溧水區(qū)中醫(yī)院 藥劑科，南京 211200；2 南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，南京210046

血必凈注射液是以清代醫(yī)家王清任的血府逐瘀湯為底方研制而成，是于2004 年批準上市的中藥二類新藥，具有活血化瘀、清熱解毒、扶正固本的功效，臨床常用于治療因感染誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，也可作作多器官功能失常綜合征的臟器功能受損期配合治療[1]。其組方為紅花、川芎、赤芍、當(dāng)歸、丹參5 味中藥，其含有多個明確的藥理藥效。主要次生代謝產(chǎn)物如羥基紅花黃色素A、阿魏酸、芍藥苷、丹酚酸A 等[2～5]，其與藥理藥效對應(yīng)關(guān)系見圖1。

圖1 血必凈注射液中次生代謝產(chǎn)物與藥理藥效關(guān)系

血必凈注射液作為常見中藥注射劑在臨床使用過程中易導(dǎo)致皮疹、瘙癢、呼吸困難、心悸，甚至過敏性休克等過敏現(xiàn)象[6]。其含有的次生代謝產(chǎn)物在注射給藥過程中有著較為明確的過敏反應(yīng)，如含綠原酸中藥注射劑臨床使用中是最易致敏的有效成分[7]。丹酚酸A、B 可能與黃疸等膽紅素相關(guān)不良反應(yīng)有關(guān)[8]。藁本內(nèi)酯則可能引發(fā)藥物代謝酶誘導(dǎo)效應(yīng)[9]，導(dǎo)致代謝性藥物相互作用的發(fā)生。監(jiān)測以上成分的含有量及含量的穩(wěn)定性顯得尤為重要。

基于對血必凈注射液的功效物質(zhì)基礎(chǔ)、臨床療效及其體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，采用液相色譜與三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用法，建立準確靈敏的血必凈注射液中11 種化學(xué)成分含量測定的方法。其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 血必凈注射液中11 種化合物結(jié)構(gòu)式

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Shimadzu 30A 超高效液相色譜系統(tǒng)（島津公司，日本）；AB Triple Quad TM 5500 質(zhì)譜系統(tǒng)（AB SCIEX 公司，美國）；MS-105D 型十萬分之一天平（Mettler Toledo 公司，瑞士）。

1.2 藥品與試劑

對照品：綠原酸（批號Y22M8K36544，純度≥98%）、原兒茶醛（批號TO1013FB14，純度≥98%）、羥基紅花黃色素A（批號R17D10F106127，純度≥98%）、咖啡酸（批號W16O10B100366）、芍藥苷（批號L07M9Q60533，純度≥98%）、阿魏酸（批號L03A9D57744，純度≥98%）、迷迭香酸（批號Y06A9K67402，純度≥98%）、丹酚酸A（批號Z23D10X106625，純度≥98%）、丹酚酸B（批號P20J10F93457，純度≥98% ）、山奈素（批號Y14M11H109733，純度≥98%）、藁本內(nèi)酯（批號R19D10F106243，純度≥98%）均購自上海源葉生物科技公司；血必凈注射液（批號：1903291、1906181、1911251、1911261、1911271、2002211，規(guī)格10 mL，天津紅日藥業(yè)）。乙腈、甲醇、甲酸均色譜純；超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）（相同梯度洗脫程序：0～1 min，15%B；1～3 min，15%～40%B；3～4 min，40%～70%B；4～5 min，70%～98%B；5～6 min，98%B）；每次進樣預(yù)平衡5 min，流速：0.3 mL·min-1；進樣量：5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

三重四級桿質(zhì)譜儀配置電噴霧離子源（ESI），采用動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進行正負離子掃描，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)如下：離子源溫度550 ℃；氣簾氣壓力25 psi；噴霧氣壓力55 psi；輔助氣壓力55 psi；去溶劑氮氣流速為15 L·min-1；去溶劑氣體溫度為450 ℃。11 種成分用于定量分析的質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1；各成分提取離子流色譜圖見圖3。

圖3 對照品（A）和血必凈樣品（B）中各成分的提取離子流色譜圖

表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)

2.3 溶液的配制

2.3.1 對照品溶液分別精密稱取綠原酸、原兒茶醛、羥基紅花黃素色A、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B、山奈素、藁本內(nèi)酯的對照品適量，分別置于5 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成各對照品儲備液。精密量取上述各儲備液適量，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得含綠原酸0.500 μg·mL-1、原兒茶醛0.800 μg·mL-1、羥基紅花黃色素A 8.000 μg·mL-1、咖啡酸0.800μg·mL-1、芍藥苷8.000μg·mL-1、阿魏酸0.500μg·mL-1、迷迭香酸0.100 μg·mL-1、丹酚酸A 0.800 μg·mL-1、丹酚酸B 0.500μg·mL-1、山奈素0.800 μg·mL-1、藁本內(nèi)酯0.800 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液本品以超純水稀釋300 倍，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 檢測限、定量限精密量取“2.3.1”項下的混合對照品溶液1.0 mL 至100 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按照“2.1”與“2.2”檢測條件進樣分析，記錄色譜圖，同時不斷稀釋已知質(zhì)量濃度的對照品溶液，以信噪比為3∶1 和10∶1 分別計算檢出限和定量限，結(jié)果見表2。

表2 各成分線性關(guān)系、檢測限和定量限

2.4.2 線性關(guān)系將對照品儲備液用50%甲醇逐級 稀釋，配制成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按“2.1”和“2.2”檢測條件測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）作線性回歸。結(jié)果表明，被測11 種成分在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表2。

2.4.3 精密度試驗取批號為1911251 樣品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6 次，記錄色譜圖，測得各成分峰面積RSD 分別為綠原酸3.1%、原兒茶醛2.5%、羥基紅花黃色素A 1.6%、咖啡酸3.1%、芍藥苷2.2%、阿魏酸2.7%、迷迭香酸5.7%、丹酚酸A 3.4%、丹酚酸B 3.5%、山奈素4.8%、藁本內(nèi)酯5.1%。表明該方法有較好的精密度。

2.4.4 重復(fù)性試驗取批號為1911251 樣品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液6 份，按“2.1”和“2.2”項下檢測條件測定，記錄色譜圖，測得各成分含量RSD 分別為綠原酸3.2%、原兒茶醛2.2%、羥基紅花黃色素A 2.1%、咖啡酸3.7%、芍藥苷2.4%、阿魏酸3.0%、迷迭香酸5.1%、丹酚酸A2.9%、丹酚酸B 3.6%、山奈素4.7%、藁本內(nèi)酯4.8%。表明本方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗取批號為1911251 樣品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12h 進樣，記錄色譜圖，測得各成分峰面積RSD 分別為綠原酸2.1%、原兒茶醛2.8%、羥基紅花黃色素A 2.0%、咖啡酸1.9%、芍藥苷1.5%、阿魏酸2.0%、迷迭香酸5.3%、丹酚酸A 3.6%、丹酚酸B 3.6%、山奈素4.9%、藁本內(nèi)酯4.8%。表明供試品溶液在12h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收率試驗精密量取已知含量的血必凈注射液樣品（批號為2002211）6 份，分別加入等體積混合對照品溶液，按“2.3.2”項下制備供試品溶液，進樣5 μL 測定含量，計算加樣回收率，平均加樣回收率在97.01%～102.70%，結(jié)果見表3。

表3 血必凈中11 種成分的加樣回收率（n=6）

2.5 樣品含量測定

精密量取6 份不同批次的血必凈注射液樣品，每批3 份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”和“2.2”檢測條件進樣測定，計算被測成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 不同批號血必凈中11 種成分的含量（ng·mL-1，n=3）

由表4 看出，血必凈中羥基紅花黃色素A 含量最高，平均6884.21 ng·mL-1；其余依次為芍藥苷5212.11 ng·mL-1＞阿魏酸110.24 ng·mL-1＞原兒茶醛47.05ng·mL-1＞丹酚酸B 29.33ng·mL-1＞綠原酸22.79ng·mL-1＞丹酚酸A 17.44 ng·mL-1＞咖啡酸14.72 ng·mL-1＞藁本內(nèi)酯2.99 ng·mL-1＞山奈素2.78 ng·mL-1＞迷迭香酸1.10 ng·mL-1。除迷迭香酸含量波動外，6 批血必凈注射液中其他10 種成分的測定含量均較一致。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

分別考察了0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%乙酸水-甲醇、0.1%乙酸水-乙腈作為流動相時的色譜分離效果及峰形情況[10]，發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸水-乙腈為流動相時，各被測成分均能在6 min 內(nèi)出峰，且能與該離子通道下的其他干擾峰有效分離，峰形良好，可用于定量分析。

3.2 檢測模式的考察

根據(jù)血必凈注11 種指標(biāo)成分的化學(xué)性質(zhì)和色譜行為，考察了正、負離子掃描模式下被測成分的響應(yīng)值[11]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正離子模式下藁本內(nèi)酯產(chǎn)生的碎片離子響應(yīng)值高且穩(wěn)定，而其余10 種成分在負離子模式下響應(yīng)較好。本實驗采用同一分析周期內(nèi)、同一梯度洗脫下正、負離子同時監(jiān)測，既兼顧被測成分的質(zhì)譜碎裂性質(zhì)，又極大縮短分析的時間。

3.3 樣品含量分析

從表4 看出，除迷迭香酸外，其余10 種被測成分在6 個批次的血必凈注射液樣品中含量差異較小，說明被測成分從原料制備成血必凈注射液，其制劑工藝穩(wěn)定可控。

參考有關(guān)文獻，迷迭香酸在丹參根中含量范圍為0.11%～0.74%，可見其在血必凈注射液原料丹參中的含量相對較低，再經(jīng)過提取、純化、制劑等多個步驟，導(dǎo)致迷迭香酸在6 個不同批次樣品中的含量差異較大，同時也不排除丹參在采挖、加工炮制、貯藏方式等方面所致的損耗。

易導(dǎo)致過敏的成分如丹酚酸B、綠原酸、丹酚酸A和藁本內(nèi)酯在血必凈注射液中含量在2.73～31.99ng·mL-1，含量較低，但濃度低并不能代表其致敏能力低；且文獻并未提及的化合物仍然存在致敏性的可能性，還有待后期的試驗研究去證實。

本研究通過HPLC-ESI-MS/MS 多組分快速測定，結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù)，建立血必凈注射液中化學(xué)成分的定量分析，該方法準確可靠，可為進一步規(guī)范其質(zhì)量控制提供參考，為后期血必凈注射液有效成分致敏原篩查提供研究基礎(chǔ)。